,,,，, ,, ,,*

(1.中國科學(xué)院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000； 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院,甘肅蘭州 730070； 4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009)

響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取獨(dú)活蛇床子素工藝的研究

趙美榮1,2,李雪虎1,劉耀明3,姚海潮4，陸錫宏1,周翔1,辛志君1,色珠4,梁劍平1,*

(1.中國科學(xué)院近代物理研究所,甘肅蘭州 730000； 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院安寧分院,甘肅蘭州 730070； 4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009)

采用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化纖維素酶提取蛇床子素的工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取酶解pH、纖維素酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度作為影響因子,以蛇床子素得率為響應(yīng)值,利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理,研究各自變量及其交互作用對(duì)得率的影響,模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型,確定最佳提取條件為：酶解pH為5.0,酶解時(shí)間60min,酶解溫度50℃,纖維素酶量3%。在此優(yōu)化工藝條件下,蛇床子素的得率為0.926%。

獨(dú)活,蛇床子素,纖維素酶提取,BBD

獨(dú)活是傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根[1],其主要功能有祛風(fēng)除濕、通痹止痛的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明,香豆素類化合物為其主要有效部位之一,其中又以蛇床子素的含量最高[2-3],具有抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗焦慮[6]等作用。如何高效地提取蛇床子素對(duì)于獨(dú)活的新藥開發(fā)具有重要作用。蛇床子素的提取一般采用傳統(tǒng)的乙醇回流法[7],該方法簡(jiǎn)便易行,設(shè)備要求低,但是操作時(shí)間長,提取效率低。纖維素酶提取方法具有操作簡(jiǎn)便快捷、綠色無污染、提取效率高[8-10]等特點(diǎn),已應(yīng)用到了有效成分的提取中[11]。本實(shí)驗(yàn)首次采用纖維素酶提取獨(dú)活蛇床子素,優(yōu)化提取其最佳工藝參數(shù),旨在為其產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供有力的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

獨(dú)活 西藏農(nóng)科院提供,由蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院王曉飛博士鑒定；乙腈色譜純；甲醇色譜純；乙醇,醋酸,醋酸鈉,去離子水；其余試劑均為分析純；蛇床子素對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所。

高效液相色譜儀 美國Waterse2695；DFT-250手提式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Pine-tree純水機(jī) 北京湘順源科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛇床子素含量的測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件 蛇床子素含量的測(cè)定參考鄒繼紅等方法[12-14]。色譜柱AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-水(65∶35),體積流量1.0mL/min；檢測(cè)波長322nm；柱溫25℃；進(jìn)樣體積20μL；等度洗脫。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蛇床子素對(duì)照品適量,加甲醇溶解制成1.0mg/mL的溶液。分別精密吸取不同體積的對(duì)照品溶液,依次稀釋成不同濃度的系列溶液:蛇床子素0.025、0.05、0.1、0.15、0.25、0.30、0.35mg/mL溶液。按上述色譜條件,各精密吸取溶液20μL,注入高效液相色譜儀。

1.2.2 獨(dú)活蛇床子素的提取流程及測(cè)定 原料粉碎過40目篩,精密稱取獨(dú)活樣品1.0g,置于三角瓶中,首先加入一定量的對(duì)應(yīng)pH的醋酸-醋酸鈉緩沖液,然后加入一定質(zhì)量的酶、在一定溫度下提取一定時(shí)間后,將提取液離心,收集上清液,定容到20mL,用0.45μm的微孔濾膜過濾。精密吸取供試品溶液20μL,注入液相色譜儀,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛇床子素的質(zhì)量濃度。

蛇床子素的得率公式：

式中,Y：樣品中蛇床子素的得率(%)；ρ：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的樣品濃度(μg/mL)；V：樣品定容后的體積(mL)；m：獨(dú)活原料的質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在纖維素酶用量3%、酶解時(shí)間60min、酶解溫度50℃的條件下,考察不同酶解pH對(duì)蛇床子素得率的影響；在酶解pH5.0、纖維素酶用量3%、酶解溫度40℃的條件下,考察不同酶解時(shí)間對(duì)蛇床子素得率的影響；在酶解pH5.0、纖維素酶用量3%、酶解時(shí)間60min的條件下,考察不同酶解溫度對(duì)蛇床子素得率的影響；在酶解pH5.0、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間60min的條件下,考察不同纖維素酶添加量對(duì)蛇床子素得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理[15],選取酶解pH、纖維素酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度為主要考察因素,以蛇床子素的得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用4因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1蛇床子素對(duì)照品及供試品含量測(cè)定

在上述色譜條件下,得到蛇床子素對(duì)照品和供試品的色譜圖,如圖1。分別測(cè)定不同濃度對(duì)照品的峰面積,以色譜峰面積(Y)對(duì)各質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=81546X-122060(R2=0.9952),線性范圍25～350μg/mL,呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蛇床子素對(duì)照品與樣品的高效液相色譜圖

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

圖2a為酶解pH對(duì)蛇床子素得率的影響。隨著酶解pH的不斷升高,蛇床子素得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì),pH超過5.0后,得率下降,在pH5.0時(shí)得率達(dá)到最高。這是因?yàn)檫^高或過低的pH環(huán)境都會(huì)影響酶的活性,從而影響蛇床子素的得率。故選擇酶解pH為5.0。

圖2b為酶解時(shí)間對(duì)蛇床子素得率的影響。在60min時(shí),蛇床子素的得率達(dá)到最高。超過60min后,得率趨于平緩。這是由于隨著提取時(shí)間的延長,酶解反應(yīng)進(jìn)行更充分,蛇床子素不斷從細(xì)胞溶出,進(jìn)入溶液,得率升高。因此,酶解時(shí)間定為60min。

圖2c為酶解溫度對(duì)蛇床子素得率的影響。蛇床子素的得率隨著溫度的升高而逐漸增大,并在50℃時(shí)達(dá)到一個(gè)最高值。隨后,隨著溫度的不斷升高,其得率有所降低。蛇床子素為內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu),易被水解和氧化[16]。提取過程中過高的溫度有可能造成有效成分的降解。綜合考慮,酶解溫度為50℃為宜。

圖2d是纖維素酶添加量對(duì)蛇床子素得率的影響圖。從圖中可以看出,纖維素酶在1%～3%時(shí),蛇床子素的得率變化明顯,達(dá)到3%以后,得率隨著纖維素添加量的增大而降低。這是由于在開始階段,酶的添加量未達(dá)到最佳值,酶促反應(yīng)不完全；達(dá)到最佳值時(shí),酶促反應(yīng)進(jìn)行的完全,得率達(dá)到最大；因此,選擇3%的纖維素酶添加量比較合適。

圖2 酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度、 纖維素酶添加量對(duì)蛇床子素得率的影響

2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以酶解pH(X1)、酶解時(shí)間(X2)、酶解溫度(X3)、纖維素酶量(X4)為自變量,以蛇床子素得率為響應(yīng)值(Y)，根據(jù)相應(yīng)的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過Box-Behnken設(shè)計(jì),總共有29組實(shí)驗(yàn)用于優(yōu)化蛇床子素的提取條件,具體條件如表2所示。

使用Design Expert 7.0軟件以 X1、X2、X3、X4為自變量,以蛇床子素得率為響應(yīng)值(Y)，根據(jù)相應(yīng)的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到以蛇床子素得率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程模型為：

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。從表中可知,該模型極其顯著。實(shí)驗(yàn)所得到的蛇床子素的得率與模型計(jì)算得來的相關(guān)系數(shù)R2=0.8931,修正決定系數(shù)R2=0.7861,模型p<0.001,說明該模型能解釋89.31%響應(yīng)值的變化,即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好。從方差分析表中各因素的F值看出,四個(gè)因素對(duì)蛇床子素得率影響順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>酶解溫度>纖維素酶添加量>酶解pH。一次項(xiàng)中變量酶解時(shí)間(X2)、酶解溫度(X3)、纖維素酶添加量(X4)是顯著的(p<0.05)。二次項(xiàng)X12、X32對(duì)蛇床子素的得率影響極顯著(p<0.001)。交互項(xiàng)X3X4對(duì)蛇床子素的得率影響顯著(p<0.05),X1X3則對(duì)其影響極顯著(p<0.01)。

2.3.2 響應(yīng)面圖形分析 根據(jù)回歸方程,做響應(yīng)曲面圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀,分析酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度、纖維素酶量對(duì)蛇床子素得率的影響。各兩因素交互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面圖如圖3,六幅圖分別直觀地反映了各兩因素對(duì)響應(yīng)值的影響。曲面的傾斜度反映了兩因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度,傾斜度越高,即坡度越陡,說明兩者交互作用越顯著。從圖3b中我們可以看出,酶解pH與酶解溫度兩因素的交互水平達(dá)到了高度顯著水平,這主要是由于酶解pH和酶解溫度兩因素對(duì)纖維素酶活性的影響最大,從而影響了蛇床子素的得率。

表3 響應(yīng)面模型方差分析表

注：***p<0.001為差異極顯著；**p<0.01為差異高度顯著；*p<0.05為差異顯著。

圖3 實(shí)驗(yàn)因素及其交互作用 對(duì)蛇床子素得率影響的響應(yīng)面圖

2.3.3 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證模型 選擇最適條件來檢測(cè)模型方程是否適合預(yù)測(cè)的最優(yōu)反應(yīng)值。通過模型預(yù)測(cè),纖維素酶輔助提取西藏產(chǎn)獨(dú)活的蛇床子素的最優(yōu)值：酶解pH4.97,酶解時(shí)間59.13min,酶解溫度50.31℃,纖維素酶量2.86%,蛇床子素得率的理論預(yù)測(cè)值為0.954%?？紤]實(shí)際操作,修訂提取條件如下：酶解pH為5.0,酶解時(shí)間60min,酶解溫度50℃,纖維素酶用量3%。

用修訂后的條件進(jìn)行了三次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),以保證預(yù)測(cè)值不偏離實(shí)際值,蛇床子素的得率平均為0.926%,與模型理論預(yù)測(cè)值誤差在1%以內(nèi),表明模型能較好的預(yù)測(cè)實(shí)際得率。

3 結(jié)論

本文采用纖維素酶輔助提取西藏產(chǎn)獨(dú)活的蛇床子素,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了以蛇床子素得率為響應(yīng)值,以酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和纖維素酶量為因素的數(shù)學(xué)模型,方差分析表明該模型顯著,擬合較好。通過對(duì)回歸方程優(yōu)化,得到纖維素酶提取的最佳工藝條件為：酶解pH為5.0,酶解時(shí)間60min,酶解溫度50℃,纖維素酶用量3%。對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在最優(yōu)條件下得到蛇床子素得率為0.926%,與理論值0.954%基本一致。

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Optimization of cellulase-assisted extraction of osthole from root ofRadixAngelicaPubescensusingresponse surface methodology

ZHAOMei-rong1,2,LIXue-hu1,LIUYao-ming3,YAOHai-chao4,LUXi-hong1,ZHOUXiang1,XINZhi-jun1,SEZhu4,LIANGJian-ping1,*

(1. Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China; 2. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.Anning Branch Lanzhou General Lanzhou Command CPLA,Lanzhou 730070,China; 4.Institute of Animal Science,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lasa 850009,China)

Response surface methodology(RSM)was applied to optimize the extraction conditions of osthole.Based on single factor experiment,pH,the amount of cellulase enzymolysis temperature and time were chosen as influencing factors,the yield of osthole was selected as response value.The mathematical model was established by Box-Behnken central composite design.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows:pH5.0,the amount of cellulase 3%,enzymolysis temperature 50℃,enzymolysis time 60min.In this optimal process condition,the yield of osthole was 0.926%.

RadixAngelicaPubescens;osthole;cellulase-assisted extraction;Box-Behnken design

2013-06-28 *通訊聯(lián)系人

趙美榮(1988-)，女，在讀碩士研究生,研究方向:輻射藥物學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(11105194)；院地合作項(xiàng)目(XBCD-2011-018)。

TS201.1

：B

：1002-0306(2014)01-0206-05