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(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

大蒜素的臭氧氧化合成以及在大蒜精油中的應(yīng)用研究

李文清,周華*,晏日安,黃雪松,歐仕益

(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

為了提高大蒜素的產(chǎn)率和大蒜精油中大蒜素的含量,本文以二烯丙基二硫醚為原料,以臭氧為氧化劑化學(xué)合成大蒜素,研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)物濃度、臭氧流量對大蒜素產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明：大蒜素產(chǎn)率隨著反應(yīng)時間的增加而不斷上升,但在反應(yīng)進行4h后,有副產(chǎn)物產(chǎn)生；大蒜素產(chǎn)率隨著反應(yīng)溫度、二烯丙基二硫醚濃度、臭氧流量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。采用響應(yīng)面分析法,得到了大蒜素的最優(yōu)合成條件：反應(yīng)時間為4.0h,反應(yīng)溫度為8.06℃,臭氧通入量為0.28L/min,二烯丙基二硫醚濃度為0.18mmol/mL,大蒜素產(chǎn)率為59.53%。說明最優(yōu)條件下,采用臭氧氧化大蒜精油,可以獲得富含大蒜素的大蒜精油,大蒜精油的品質(zhì)得到了提升和改善。

大蒜素,臭氧,氧化,大蒜精油

大蒜素(別名：二烯丙基硫代亞磺酸酯；英文名：Allicin)是大蒜中最具代表性的一種含硫化合物,就其風(fēng)味而言,大蒜素比大蒜中其他含硫化合物更接近新鮮大蒜的味道[1],其生物活性特別是抗氧化活性更是遠遠強于大蒜中的其他化學(xué)成分[2-4]。目前制備大蒜素的方法主要有兩種：一、從大蒜中直接提取,李瑜等報道用乙醇提取大蒜,可以得到大蒜素含量為75.03%的大蒜精油[5],但放置一段時間后,大蒜素因為分解而所剩無幾[6]。必須說明的是,目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的大蒜精油,基本都采用水蒸氣提取法[7-8]。但是該方法得到的不是大蒜素,而是以二烯丙基二硫醚為主要成分的混合物。二、化學(xué)合成法,采用雙氧水[9]或?qū)β冗^氧苯甲酸[10]為氧化劑,以二烯丙基二硫醚為反應(yīng)原料,經(jīng)化學(xué)合成得到。這兩種方法各有利弊,直接提取法,優(yōu)點在于純天然,缺點是成本較高；第二種方法優(yōu)點在于合成效率高,但是產(chǎn)品非天然。但無論采用上述哪種方法,大蒜素均不能保存太長的時間。為了提高大蒜素的產(chǎn)率和大蒜精油中大蒜素的含量,本文以二烯丙基二硫醚為模型化合物(其為水蒸氣提取大蒜精油中的主要成分),采用臭氧(家庭一般具有消毒柜,里面包括臭氧發(fā)生器)氧化制備大蒜素,研究合成大蒜素的影響因素和最優(yōu)工藝條件。并將此最優(yōu)工藝條件應(yīng)用于大蒜精油(由水蒸氣常壓蒸餾法提取得到)的臭氧氧化反應(yīng)中,得到富含大蒜素的大蒜精油,從而提高其生物活性,保持新鮮大蒜的味道。該方法是提高大蒜精油品質(zhì)的一種簡單有效方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

二烯丙基二硫醚、L-半胱氨酸、DTNB、Tris-Base緩沖劑 購自阿拉丁試劑公司；氫氧化鈉、冰乙酸 購自廣州化學(xué)試劑廠；石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、硅膠、濃鹽酸、二氯甲烷 購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；大蒜 購自于暨南大學(xué)興安超市。

TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Acculab ALC210型電子分析天平 上海第二天平儀器廠；HJ-5多功能攪拌器 常州澳華儀器有限公司;101A-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司；WFH-203(ZF-I)型三用紫外分析儀 上海顧村電光儀器廠；臭氧發(fā)生器 上海實驗儀器廠有限公司；pH檢測儀 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 大蒜素的臭氧氧化合成 稱取一定質(zhì)量的二烯丙基二硫醚,將其移至干凈的三口燒瓶中,再加入5mL無水乙醇。將三口燒瓶置于水浴鍋中,保持一定溫度,打開臭氧發(fā)生器通入臭氧。反應(yīng)開始后,用TLC法跟蹤反應(yīng)進程,待反應(yīng)結(jié)束后使用柱層析分離純化得到大蒜素。經(jīng)核磁測定產(chǎn)物結(jié)構(gòu),其氫譜和碳譜數(shù)據(jù)為1HNMR(400MHz,CD3COOD):δ 3.72～3.92(m,4H),5.20～5.56(m,4H),5.88～5.99(m,2H)ppm;13CNMR(75MHz,CD3COOD):δ 35.02、59.90、119.10、124.00、125.80、132.90ppm。與文獻報道一致[10]。

在5mL的容量瓶中的依次加入1.0mmol/L半胱氨酸溶液0.5mL,稀釋后的大蒜素樣品液0.5mL,在26℃保溫15min。而后再加入1mL 1.0mmol/L DTNB溶液,50mmol/L pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液定容,26℃下保溫15min,412nm波長測定其吸光值A(chǔ)。

大蒜素含量計算方法如下:

C大蒜素=ΔA412×d/(2×14150ml/mmol)

ΔA412=A0-A

式中:d為總稀釋倍數(shù);在本實驗中稀釋倍數(shù)為10000。

1.2.3 大蒜精油的提取 選擇顆粒完整、無霉?fàn)€的大蒜200g,大小不限。切去大蒜的鱗莖盤,去掉大蒜干枯鱗片葉備用。用破碎機破碎,在30℃下酶解1h。將酶解后的大蒜,按固液比1∶2加入394.5mL蒸餾水中,上鍋蒸餾。電熱套功率保持在50～75W,時間1.5h,收集蒸出料液備用。用二氯甲烷提取分離大蒜油,經(jīng)硅膠脫水和活性炭脫色精制,得到大蒜精油。

1.2.4 大蒜精油的臭氧氧化 將1.2.3提取的大蒜精油配成一定濃度的乙醇溶液,按1.2.1實驗步驟進行臭氧氧化。反應(yīng)時間為4h,反應(yīng)溫度為8℃,臭氧流量為0.28L/min,臭氧氧化大蒜精油。用TLC法監(jiān)測反應(yīng)體系中的二烯丙基二硫醚已經(jīng)反應(yīng)完全,而后過柱分離,得到大蒜素粗品,再按步驟1.2.2的分析方法,計算大蒜素產(chǎn)率,公式如下：

式中：m(大蒜素)為反應(yīng)得到的大蒜素質(zhì)量；m(二烯丙基二硫醚)為反應(yīng)物中所含二烯丙基二硫醚質(zhì)量。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 反應(yīng)溫度的影響 控制反應(yīng)時間為3h,二烯丙基二硫醚乙醇溶液濃度為 0.4mmol/mL,臭氧流量為0.15L/min的情況下,改變反應(yīng)溫度,考察其對大蒜素產(chǎn)率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.5.2 反應(yīng)時間的影響 在反應(yīng)溫度為20℃,二烯丙基二硫醚乙醇溶液濃度為0.4mmol/mL,臭氧流量為0.15L/min的條件下,考察反應(yīng)時間對大蒜素產(chǎn)率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.5.3 臭氧流量的影響 在反應(yīng)溫度為20℃,二烯丙基二硫醚乙醇溶液濃度為0.4mmol/mL,反應(yīng)時間為3h的條件下,考察臭氧流量對大蒜素產(chǎn)率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.5.4 原料濃度的影響 在反應(yīng)溫度為20℃,臭氧流量為0.15L/min,反應(yīng)時間為3h的條件下,考察二烯丙基二硫醚乙醇溶液濃度對大蒜素產(chǎn)率的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.2.6 Box-Behnken設(shè)計實驗 應(yīng)用Design Expert軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,以大蒜素的產(chǎn)率為響應(yīng)值,在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、臭氧濃度、原料濃度四個因素進行響應(yīng)曲面實驗設(shè)計。因素水平見表1。每個實驗點做三次重復(fù)。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平表

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 以SPSS軟件作統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1臭氧氧化合成大蒜素的影響因素探討

2.1.1 反應(yīng)溫度對大蒜素合成產(chǎn)率的影響 由圖1可知,在保持其他條件不變的情況下,大蒜素的產(chǎn)率先是隨著反應(yīng)溫度的升高而增加,在10℃時產(chǎn)率達到最大值(46.99%),隨后溫度繼續(xù)升高,產(chǎn)率下降,溫度升到30℃時產(chǎn)率僅為27.34%。故選取溫度0、10、20℃為響應(yīng)面溫度的三水平。

2.1.2 反應(yīng)時間對大蒜素產(chǎn)率的影響 從圖2可知,隨著反應(yīng)時間的增加,大蒜素的產(chǎn)率不斷提高,反應(yīng)至1h,大蒜素的產(chǎn)率為14.37%,反應(yīng)進行到5h,產(chǎn)率達到40.12%。通過TLC法跟蹤反應(yīng)進程,當(dāng)反應(yīng)進行到4h時,產(chǎn)物中伴隨有副產(chǎn)物的出現(xiàn)。故選取時間3、3.5、4h為響應(yīng)面時間的三水平。

圖1 反應(yīng)溫度對大蒜素產(chǎn)率的影響

圖2 反應(yīng)時間對大蒜素產(chǎn)率的影響

2.1.3 臭氧流量對大蒜素產(chǎn)率的影響 從圖3可以看出,隨著臭氧流量從0.10L/min增大到0.30L/min的過程中,大蒜素的產(chǎn)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)臭氧流量為0.20L/min時,大蒜素的產(chǎn)率最高為38.63%,之后隨著臭氧流量的增大,大蒜素的產(chǎn)率反而下降。這可能是由于臭氧量增大到一定程度后,臭氧氧化了二烯丙基二硫醚中的兩個雙鍵,產(chǎn)生副產(chǎn)物。故選取臭氧流量0.15、0.20、0.25L/min為響應(yīng)面臭氧流量的三水平。

圖3 臭氧流量對大蒜素產(chǎn)率影響

2.1.4 原料濃度對大蒜素產(chǎn)率的影響 從圖4可以看出,隨著二烯丙基二硫醚的濃度不斷增大,大蒜素的產(chǎn)率表現(xiàn)為先增加后減少,當(dāng)二烯丙基二硫醚濃度為0.2mmol/mL時,大蒜素的產(chǎn)率最高,達到48.32%。隨后,大蒜素的產(chǎn)率不斷降低。故選取二烯丙基二硫醚濃度0.2、0.3、0.4mmol/mL為響應(yīng)面二烯丙基二硫醚濃度的三水平。

圖4 反應(yīng)物濃度對大蒜素產(chǎn)率的影響

2.2運用響應(yīng)面法分析影響因素并確定最優(yōu)條件

2.2.1 臭氧氧化合成大蒜素的實驗數(shù)據(jù)分析 以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、臭氧流量、原料濃度為四個可控的工藝參數(shù),以大蒜素產(chǎn)率為實驗指標(biāo),采用Box-Behnken設(shè)計方法來優(yōu)化大蒜素合成工藝條件,實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計實驗的結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注：*：p<0.05,表示顯著；**：p<0.01,表示極顯著。 通過Design-Expert軟件,對表3實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,獲得了大蒜素產(chǎn)率對編碼自變量反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、臭氧流量、原料濃度的二次多元回歸方程：Y(%)=30.38750+2.99725×A-98.03333×B+8.88167×C+91.23333×D+0.67250×A×B-0.20000A×C-1.26500×A×D-7.75000×B×C-40.50000×B×D-12.40000×C×D-0.12343×A2+131.79167×B2+0.011667×C2-38.33333×D2。該方程回歸顯著,R2=0.9803,說明回歸方程的擬合程度良好,失擬較小,可以用該方程代替真實實驗點進行分析。方程中A、B、C對吸光值的影響達顯著水平,方程中A2、B2對吸光值的影響也達極顯著水平。表明實驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。精密度>4.0是令人滿意的,而本模型的精密度為23.83,說明模型適當(dāng)。

2.1.5 響應(yīng)面分析及反應(yīng)的最優(yōu)條件 采用Design-Expert軟件分析了反應(yīng)的最優(yōu)化條件,得到臭氧氧化合成大蒜素的最佳條件為反應(yīng)時間為4.0h,反應(yīng)溫度為8.06℃,臭氧通入量為0.28L/min,二烯丙基二硫醚濃度為0.18mmol/mL。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性,采用上述優(yōu)化條件下合成大蒜素,測得大蒜素產(chǎn)率為59.53%,與理論預(yù)測值59.77%相比,其相對誤差較小。因此,基于響應(yīng)面分析法所得的臭氧氧化合成大蒜素的反應(yīng)條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實用價值。

2.3大蒜精油的臭氧氧化

采用2.1.5提到的反應(yīng)條件對大蒜精油進行臭氧氧化,大蒜素的綜合產(chǎn)率為63.61%。該值比理論預(yù)測值59.77%要略高一些,原因可能是：大蒜精油包含二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、二烯丙基硫醚等混合物,這些化合物之間可以相互轉(zhuǎn)化,并存在一定的化學(xué)平衡,在二烯丙基二硫醚氧化生成大蒜素的過程中,使上述平衡發(fā)生移動,生成了比理論值更多的大蒜素。我們將氧化后的大蒜精油進行抗氧化活性研究,與氧化前的大蒜精油相比,其抗氧化性得到顯著提高,相關(guān)內(nèi)容將另文發(fā)表。

3 結(jié)論

3.1 以單一的模型化合物二烯丙基二硫醚為反應(yīng)原料,以臭氧為氧化劑,合成了大蒜素純品。研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)物濃度、臭氧流量對大蒜素產(chǎn)率的影響：大蒜素的產(chǎn)率隨著反應(yīng)時間的增加而提高,但是在反應(yīng)時間超過4h后,有副產(chǎn)物二烯丙基三硫醚等產(chǎn)生；大蒜素產(chǎn)率隨著反應(yīng)溫度、二烯丙基二硫醚濃度、臭氧流量的增加產(chǎn)率表現(xiàn)為先上升而后下降。

3.2 針對單因素反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)物濃度、臭氧流量對大蒜素產(chǎn)率的影響,采用響應(yīng)面法得到優(yōu)化后的臭氧氧化合成大蒜素的反應(yīng)條件：反應(yīng)時間為4h,反應(yīng)溫度約為8℃,臭氧通入量為0.25L/min,二烯丙基二硫醚乙醇溶液濃度為0.20mmol/mL。

3.3 采用最優(yōu)條件下,用臭氧氧化大蒜精油,測定大蒜精油中大蒜素反應(yīng)前后的含量,大蒜素產(chǎn)率達到63.96%,說明最優(yōu)條件下,采用臭氧氧化大蒜精油,可以獲得富含大蒜素的大蒜精油,使大蒜精油的品質(zhì)得到提升。

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Study on the synthesis of allicin by using ozone and the application of the method on garlic oil

LIWen-qing，ZHOUHua*,YANRi-an，HUANGXue-song，OUShi-yi

(Department of Food Science and Technology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

In order to attain the higher yield of allin and higher content of that in garlic oil,the key effect factors were investigated:as the reaction time was prolonged,the yield of allicin was increased,but the byproduct of reaction was presented after more than four hours. As the reaction temperature and reactant concentration and the ozone flow increased,the yield of allicin was first increasing and then decreasing. The respond surface methodology was used to optimize the synthesis condition of the reaction:the reaction time was 4h,and the reaction temperature was about 8.06℃,and the ozone flow was 0.28L/min,and reactant concentration was 0.18mmol/mL. In the above optimized synthesized condition,the ozone was used to oxidize the garlic oil,the yield of allicin was 59.53%. The garlic oil with high content of allicin could be obtained and the quality of garlic oil could be improved in the above-mentioned optimized condition.

allicin;ozone;oxidation;garlic oil

2013-06-28 *通訊聯(lián)系人

李文清(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：大蒜化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(31101323)資助。

TS234.3

：B

：1002-0306(2014)01-0202-05