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(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

加熱后低溫放置對(duì)美拉德反應(yīng)特征顏色和抗氧化性的影響

張莎莎,景浩*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

為分析短時(shí)加熱與低溫相結(jié)合對(duì)美拉德反應(yīng)顏色特征、抗氧化性和反應(yīng)進(jìn)程的影響,利用木糖與甘氨酸模式美拉德反應(yīng)體系,在60℃預(yù)加熱0、0.5、1h后,置于4℃條件下觀測(cè)反應(yīng)變化。通過吸光值和色差的測(cè)定、紫外可見吸收光譜的分析、ABTS及DPPH自由基清除率的變化反應(yīng)體系特征顏色和抗氧化性的變化。結(jié)果表明,60℃加熱時(shí)間越長(zhǎng),木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系的初始吸光值、b值和自由基清除率越大且變化幅度較快,而初始L值和a值則越小。在4℃下放置,反應(yīng)體系的吸光值均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；L、a、b值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；加熱0和0.5h的反應(yīng)體系在紫外區(qū)265nm處出現(xiàn)特征峰,而加熱1h的體系無此特征峰出現(xiàn),不同體系在可見光區(qū)均在580nm和630nm處出現(xiàn)特征峰,且隨著反應(yīng)時(shí)間的增加吸光強(qiáng)度不斷增大；ABTS、DPPH自由基清除率均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),但ABTS自由基清除率的增加較明顯,而DPPH自由基清除能力增加較平緩。

木糖,甘氨酸,美拉德反應(yīng),短時(shí)加熱,低溫反應(yīng)

美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction,MR)又稱羰氨反應(yīng),主要發(fā)生在含有羰基和含有氨基的化合物中,是食品色澤和風(fēng)味的主要來源[1]。但是食品基質(zhì)一般較復(fù)雜,且發(fā)生美拉德反應(yīng)后所生成的產(chǎn)物也比較復(fù)雜,故常用含有羰基的糖和含有氨基的氨基酸建立模式美拉德反應(yīng)體系來進(jìn)行研究[2],單一模式的美拉德反應(yīng)的整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程受糖和氨基酸的種類、糖和氨基酸的比例、pH、加熱溫度、緩沖液、反應(yīng)時(shí)間、溶劑等因素的影響,已有很多研究證實(shí)溫度和時(shí)間的變化對(duì)美拉德反應(yīng)的影響最重要,隨著溫度的升高,美拉德反應(yīng)的速率也將隨之增加[3]。美拉德反應(yīng)生成類黑精一般需要經(jīng)歷三個(gè)不同的階段：初級(jí)、中級(jí)和終級(jí)三個(gè)階段,而中級(jí)階段的還原酮路線,Osulose路線和Strecker路線三個(gè)不同的途徑產(chǎn)生的中間產(chǎn)物是生成大分子類黑精不可或缺的步驟[4],也是特征色產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。根據(jù)Murakami等[5]的報(bào)道可知在美拉德反應(yīng)初期木糖-甘氨酸生成了藍(lán)色物質(zhì),木糖-組氨酸生成了黃色物質(zhì)、木糖-精氨酸生成了紅色物質(zhì),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,這些藍(lán)色、黃色和紅色物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成棕褐色物質(zhì)。孫倩等[6]報(bào)道了,木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在60℃下便會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)由藍(lán)色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。尹姿等[7]報(bào)道,木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在30℃下加熱48h,便會(huì)生成藍(lán)色產(chǎn)物。張莎莎等[8]報(bào)道,木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在4℃下放置15d,在第6d轉(zhuǎn)變?yōu)榈{(lán)色,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)體系的藍(lán)色逐漸加深,直至15d時(shí)變成深藍(lán)色。綜合上述報(bào)道可知,不同溫度下生成特征色所需要的時(shí)間和反應(yīng)進(jìn)程都有一定的差異。為了控制美拉德反應(yīng)的進(jìn)程,研究美拉德反應(yīng)特征色的生成過程,本研究將60℃加熱和4℃低溫放置兩種溫度條件結(jié)合,在60℃加熱0、0.5、1h后,然后置于4℃條件下避光進(jìn)行反應(yīng),從而來研究復(fù)合溫度條件對(duì)木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系特征性藍(lán)色生成和抗氧化性的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

D-木糖(D-xylose,MW150.13,含量98.5%) 購于北京嘉康源科技發(fā)展有限公司；L-甘氨酸(L-glycine,MW75.07,含量大于99%) 購于天津華陽生物科技有限公司；碳酸氫鈉(NaHCO3,MW84.01)、乙醇(Ethanol,EtOH,純度≥95%) 均購于北京化工廠；2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2′2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH) 均購于美國Sigma 公司。

XB 220A電子天平 Precisa Gravimetrics AG；QL-901渦流振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;pHS-3C+酸度計(jì) 成都市紀(jì)方舟科技有限公司；ADCI系列全自動(dòng)色差計(jì) 北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司；Model 680酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；UV-1200型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美拉德反應(yīng)體系溶液的制備 木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系中各物質(zhì)的最終摩爾濃度為：木糖1mol/L,甘氨酸0.33mol/L,NaHCO30.05mol/L,加入乙醇的體積占反應(yīng)體系總體積的20%,用8mol/L的HCl溶液將體系pH調(diào)至7.5；將配制好的反應(yīng)體系分成3等份,分別在60℃條件下預(yù)先加熱0、0.5、1h后,將預(yù)處理后的三個(gè)體系置于4℃條件下反應(yīng)15d,每隔3d取樣一次,樣品置于-20℃冰箱中待用。

1.2.2 吸光值和顏色的測(cè)定 取各樣品原溶液300μL到96孔板中,用酶標(biāo)儀分別在450、570、630nm下測(cè)吸光值；用UV-1200型紫外分光光度計(jì)對(duì)樣品液從200～700nm進(jìn)行紫外可見光譜掃描,為保證讀數(shù)在合適的范圍內(nèi),可以將反應(yīng)物稀釋一定倍數(shù)。

用ADCI-60-C型全自動(dòng)色差儀測(cè)定樣品溶液Lab色差值的變化,其中L表示從0(黑色)至100(白色)范圍內(nèi)樣品的亮度；根據(jù)色差計(jì)的設(shè)定,a值表示從-128(綠色)至+127(紅色)范圍內(nèi)樣品的顏色；b值表示從-128(藍(lán)色)至+127(黃色)范圍內(nèi)樣品的顏色。色差儀先預(yù)熱30min,用標(biāo)準(zhǔn)黑板校準(zhǔn)黑色后,蓋上標(biāo)準(zhǔn)白板校準(zhǔn)白色,測(cè)定時(shí)取5mL樣品原液于玻璃皿中,每個(gè)樣品測(cè)3次,記錄L、a、b值。

1.2.3 ABTS自由基清除率測(cè)定 參照尹姿等[7]的方法。簡(jiǎn)述如下,將0.5mL 14mmol/L ABTS和0.5mL 4.9mmol/L過硫酸鉀混合,使ABTS和過硫酸鉀的終濃度分別為7mmol/L和2.45mmol/L。混合溶液在室溫、避光條件下靜置過夜,形成ABTS工作液,在使用前用PBS緩沖液稀釋(15～30倍),使其在630nm波長(zhǎng)下的吸光值為0.50±0.02,形成ABTS工作液。在96孔板中進(jìn)行ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)。在樣品孔中加入10μL樣品、90μL ABTS自由基溶液(Abs樣品),在顏色對(duì)照孔中加入10μL樣品、90μL PBS緩沖液作為樣品顏色對(duì)照(Abs對(duì)照),在空白對(duì)照孔中加入10μL PBS、90μL ABTS工作液(Abs空白)。在黑暗室溫環(huán)境下放置8min,在630nm波長(zhǎng)下讀取吸光值(Abs),帶入下式計(jì)算：

ABTS自由基清除率(%)=[Abs空白-(Abs樣品-Abs對(duì)照)]/Abs空白×100

1.2.4 DPPH自由基清除率測(cè)定 參照李琦[9]測(cè)定的方法并稍作修改。簡(jiǎn)述如下,稱取9.8mg DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶于10mL無水乙醇中,配制成濃度為25μmol/L的儲(chǔ)備液,使用前用無水乙醇稀釋儲(chǔ)備液至濃度為1.56μmol/L的工作液。在96孔板中進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。在樣品孔中加入15μL樣品、60μL Tris-HCl 和150μL DPPH工作液(Abs樣品),在顏色對(duì)照孔中加入15μL樣品、60μL Tris-HCl和150μL無水乙醇(Abs對(duì)照),在空白對(duì)照孔中加入15μL無水乙醇、60μL Tris-HCl和150μL DPPH工作液(Abs空白)。在黑暗室溫環(huán)境下放置30min,在520nm波長(zhǎng)下讀取吸光值(Abs),帶入下式計(jì)算：

DPPH自由基清除率(%)=[Abs空白-(Abs樣品-Abs對(duì)照)]/Abs空白×100

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)的顯著性差異由Minitab軟件進(jìn)行分析。對(duì)均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(One way analysis of variance,One way ANOVA),進(jìn)一步以Tukey多重比較進(jìn)行檢驗(yàn),得到各組均數(shù)間的顯著性差異(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系紫外光譜掃描

由圖1可知,在200～400nm的紫外光區(qū),60℃加熱0和0.5h的木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在整個(gè)反應(yīng)過程中均在265nm處出現(xiàn)特征峰,而60℃加熱1h的反應(yīng)體系并無此特征峰出現(xiàn)。60℃加熱0h的體系在4℃下放置第3d在265nm處出現(xiàn)明顯的特征峰,且隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,吸光強(qiáng)度逐漸呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；60℃加熱0.5h的體系在加熱完成時(shí)即在265nm處出現(xiàn)了明顯的特征峰,隨著反應(yīng)進(jìn)行至第6d時(shí),特征峰消失；而60℃加熱1h的體系從加熱結(jié)束至4℃放置的整個(gè)反應(yīng)過程中都未在265nm處出現(xiàn)特征峰。根據(jù)Jing等[3]的報(bào)道可知,在265nm處容易出現(xiàn)α-二羰基化合物,結(jié)合色差的變化,60℃加熱0.5h的體系,4℃放置反應(yīng)至第9d和60℃加熱1h的體系沒有明顯的藍(lán)色產(chǎn)生,我們可推知：265nm處的α-二羰基化合物可能是生成藍(lán)色物質(zhì)的主要前體物質(zhì)。

圖1 Xyl-Gly MR體系的紫外光譜

2.2木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系可見光譜掃描

由圖2可知,在400～700nm的可見光區(qū),60℃加熱不同時(shí)間的木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系均在580nm和630nm處出現(xiàn)特征峰,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),吸光強(qiáng)度均增加。60℃加熱0h的體系在4℃下放置至第9d時(shí)出現(xiàn)明顯的特征峰,60℃加熱0.5h的體系4℃下僅放置3d便有特征峰出現(xiàn),而60℃加熱1h體系加熱完成后便有特征峰出現(xiàn)。60℃加熱時(shí)間越長(zhǎng),特征峰出現(xiàn)時(shí)間越早,且在4℃下放置的0～15d內(nèi),隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)體系的吸光強(qiáng)度上升越快。有報(bào)道木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系的顏色特征物主要出現(xiàn)在580nm和625nm處[10],我們檢測(cè)的顏色特征峰出現(xiàn)在580nm和630nm處,主要是由于環(huán)境或檢測(cè)儀器的略微不同所致。根據(jù)400～700nm可見光區(qū)的光譜掃描結(jié)果,同時(shí)結(jié)合色差和吸光值的變化,可推知：60℃加熱能明顯促進(jìn)低溫反應(yīng)的進(jìn)行。

圖2 Xyl-Gly MR體系的可見光譜

2.3木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系吸光值的變化

由圖3可知,木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在60℃加熱時(shí)間越長(zhǎng),初始吸光值越大。4℃下放置,在0～15d內(nèi),隨著4℃放置時(shí)間的延長(zhǎng),三個(gè)體系在450、570、630nm處的吸光值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),上升幅度依次為：1h>0.5h>0h。60℃加熱時(shí)間越長(zhǎng)吸光值的變化越快,但當(dāng)反應(yīng)體系的吸光值高達(dá)2.5以上時(shí),反應(yīng)體系的顏色過深可能致使在任何波長(zhǎng)下都有較高的吸光值,并不能代表特征色的變化。根據(jù)Mruia等[11]和Murakami等[5]的綜合報(bào)道可得出：627nm處有明顯的特征峰,經(jīng)分離鑒定可知此處產(chǎn)生的為藍(lán)色物質(zhì)。由于儀器的略微差異,630nm為藍(lán)色物質(zhì)特征峰,同時(shí)根據(jù)圖3中630nm處木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系吸光值的變化發(fā)現(xiàn),60℃加熱0.5h體系僅在4℃條件下放置3d的吸光值和60℃加熱0h體系在4℃下放置12d的吸光值相差無幾,而60℃加熱1h后的吸光值已較大。450nm的吸光值常用來判斷美拉德反應(yīng)的褐變程度[12],450nm處吸光值的不斷增大可判斷整個(gè)體系的褐變程度不斷的增強(qiáng)。綜合450、570和630nm處吸光值的變化可推知,加熱能明顯促進(jìn)低溫反應(yīng)的發(fā)生和進(jìn)行。

圖3 Xyl-Gly MR體系的吸光值變化

2.4木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系顏色的變化

由表1可知,木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在60℃加熱的1h內(nèi),隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),L、a值均迅速降低，b值呈升高趨勢(shì)。60℃分別加熱0、0.5、1h的體系,在4℃下放置的0～15d內(nèi),L、a、b值也均隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),加熱時(shí)間越長(zhǎng)的體系在4℃下放置時(shí)色差值下降的越快。根據(jù)肉眼觀察,60℃加熱0h的體系,4℃下放置,反應(yīng)第6d出現(xiàn)淡藍(lán)色,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),藍(lán)色逐漸加深；60℃加熱0.5h體系,加熱結(jié)束后,反應(yīng)體系呈現(xiàn)淡藍(lán)綠色,4℃下放置,反應(yīng)進(jìn)行至第3d便呈現(xiàn)深藍(lán)色,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)體系的顏色逐漸加深,反應(yīng)進(jìn)行至第9d時(shí)肉眼觀察呈現(xiàn)黑色,可能是由于反應(yīng)體系顏色較深,才導(dǎo)致用色差儀檢測(cè)時(shí)光線無法返回,致使無數(shù)值呈現(xiàn)；60℃加熱1h體系,加熱完成后,反應(yīng)體系呈現(xiàn)綠色,4℃下放置,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)體系的顏色越來越深。總體而言,由L、a、b值變化和下降程度的不同可推知：60℃加熱促進(jìn)了木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系的發(fā)生和進(jìn)行,但加熱時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致反應(yīng)體系顏色變化過快,且顏色較深,無法得到所需要的特征藍(lán)色。

表1 Xyl-Gly MR體系的色差變化

注：數(shù)值=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,見1.2.5。上標(biāo)字母a～d的不同表示同一行不同反應(yīng)時(shí)間有顯著性差異；而上標(biāo)字母A～C的不同則表示同一列不同時(shí)間有顯著性差異(p<0.05)。 -無數(shù)值,推測(cè)可能是由于反應(yīng)體系的顏色過深,導(dǎo)致光線無法返回,故無數(shù)值呈現(xiàn)。

2.5木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系A(chǔ)BTS/DPPH自由基清除率

由圖4可知,60℃加熱時(shí)間越長(zhǎng),反應(yīng)體系的起始自由基清除能力越大。結(jié)合色差和吸光值的變化,可推知反應(yīng)體系的顏色越深,ABTS自由基清除能力越強(qiáng)。將反應(yīng)溶液稀釋15倍后,整個(gè)反應(yīng)體系仍具有很高的ABTS自由基清除率,這和張凌燕等[2]的報(bào)道結(jié)果相一致。60℃加熱0、0.5、1h后,4℃下放置15d,三個(gè)體系的ABTS自由基清除率呈緩慢上升趨勢(shì),具體變化趨勢(shì)為1h加熱組>0.5h加熱組>0h未加熱組。未加熱(0h)和加熱(0.5、1h)組的初始DPPH自由基清除率有明顯的差異,但隨著反應(yīng)的進(jìn)行,未加熱組DPPH自由基清除率逐漸增加,在15d時(shí)與加熱組接近同一水平。4℃下放置15d,加熱組DPPH自由基清除率無明顯的變化。由此可知,同一反應(yīng)體系A(chǔ)BTS和DPPH自由基清除率差異的出現(xiàn),可能與兩者本身的清除原理不同有必然的聯(lián)系。

圖4 Xyl-Gly MR體系的ABTS/DPPH自由基清除能力變化

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過比較木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系在60℃下分別加熱0、0.5、1h后的變化,證實(shí)60℃加熱較短時(shí)間可以促進(jìn)4℃低溫反應(yīng)的進(jìn)行,但是加熱時(shí)間過長(zhǎng),由于溫度過高,反應(yīng)速率過快,可能跨越特征色產(chǎn)物的生成過程。整體而言,60℃加熱后在4℃下放置,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),各個(gè)反應(yīng)體系的顏色逐漸加深,且60℃加熱0h的體系較加熱0.5和1h的體系顏色鮮亮些,結(jié)合各個(gè)指標(biāo)可知：60℃加熱0h的體系在反應(yīng)進(jìn)行至12d時(shí)產(chǎn)生最優(yōu)的亮藍(lán)色,而60℃加熱0.5h體系明顯縮短產(chǎn)生藍(lán)色的時(shí)間,在反應(yīng)進(jìn)行至3d時(shí)便產(chǎn)生藍(lán)色,但60℃加熱1h的體系卻沒有明顯的藍(lán)色生成。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了反應(yīng)體系的顏色越深A(yù)BTS自由基清除率越高,而DPPH自由清除率在顏色較深時(shí)變化不大,這可能與兩者自由基清除原理不同有關(guān)。結(jié)合200～400nm紫外光譜掃描結(jié)果推知：265nm處物質(zhì)的存在與否可能與藍(lán)色物質(zhì)的生成有一定的關(guān)系,但仍須進(jìn)一步研究。在以后的研究中可進(jìn)一步研究反應(yīng)初期不同物質(zhì)的產(chǎn)生和特征色物質(zhì)產(chǎn)生的相互關(guān)系。本文研究結(jié)果對(duì)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備具有一定的參考價(jià)值。

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Effect of two phases of high and low temperatures on characteristic color development and antioxidant activity in Maillard reaction system

ZHANGSha-sha,JINGHao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Characteristic color development and free radical scavenging activity in Xyl-Gly Maillard reaction system was investigated under two phases of high and low temperatures. The Xyl-Gly Maillard reaction system was heated at 60℃ for 0,0.5,1h and then set at 4℃ for 15d. The results showed that,the longer time heated at 60℃,the greater initial values of absorbance,b and free radical scavenging rates. The absorbance intensity gradually increased,and the color values of L,a,b all decreased during 15d at 4℃. The characteristic peaks at 265,580 and 630nm appeared on the UV-Vis,with increased absorbance intensity at 580 and 630nm and disappearance of the peaks at 265nm. ABTS and DPPH radical scavenging rates increased with increasing time at 4℃. Preheating could promote the Maillard reaction in low temperature,but the characteristic peak at 265nm disappeared as heating temperature increased.

xylose;glycine;Maillard reaction;short time heated;low temperature reaction

2013-06-17 *通訊聯(lián)系人

張莎莎(1989-)，女，碩士，研究方向：美拉德藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物的制備技術(shù)。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題子課題(2011BAD23B02)。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0061-05