李 廣， 陳龍聰， 李 賢， 楊 萌， 陳萌夢(mèng)， 熊興良

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，重慶400016；

2.重慶大學(xué) 生物力學(xué)與組織工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044)

0 引 言

由于非心臟原因胸痛的發(fā)生率很高，所以,鑒別短暫心肌缺血和心絞痛病人一直為臨床上的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。利用心電圖檢測(cè)ST段抬高只能提供有限的靈敏度和特異性。在缺乏心肌缺血“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)方法的情況下，病人需要在12～24 h內(nèi)頻繁地接受一系列煩瑣的非特異性排查測(cè)試。盡管心肌壞死生化標(biāo)志物如肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin,Myo)和肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTn)對(duì)于治療是非常重要的參數(shù)，但這些物質(zhì)僅在細(xì)胞出現(xiàn)不可逆病變6 h后才從心肌細(xì)胞中釋放出來(lái)。因此，不能用于心肌缺血的早期診斷。

無(wú)論病人是否出現(xiàn)心肌梗死，在病人癥狀剛發(fā)生時(shí)(cTn出現(xiàn)之前)，尋找一種可靠、快速、低檢測(cè)限的心肌缺血檢測(cè)方法顯得非常必要。缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin,IMA)是近年FDA批準(zhǔn)的用于評(píng)估心肌缺血的唯一生化標(biāo)志物，現(xiàn)廣泛采用的IMA檢測(cè)方法是由Bar-Or等人[1]建立的白蛋白結(jié)合鈷試驗(yàn)(AC試驗(yàn))。但該方法不是直接檢測(cè)IMA，而是通過(guò)間接檢測(cè)血液中白蛋白(human serum albumin,HSA)與鈷離子結(jié)合從而間接檢測(cè)IMA，因此,ACB法的檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性偏多；另外，當(dāng)患者血液中白蛋白濃度低于34 g/L[2]時(shí)，該方法無(wú)法用于檢測(cè)IMA。再者，ACB法需使用染色劑DTT，該物質(zhì)不穩(wěn)定，熔點(diǎn)很低，在空氣易揮發(fā)，且含有刺激性氣味，對(duì)人體健康會(huì)造成影響。近年來(lái)又有學(xué)者[3]提出了ELISA方法檢測(cè)IMA，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)(大于1 h)，處理過(guò)程復(fù)雜，操作過(guò)程繁瑣。

SPR生物傳感器基于入射光與金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理，建立探測(cè)生物分子間相互作用的生化分析技術(shù)，具有實(shí)時(shí)、快速、靈敏、免標(biāo)記及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。已在病毒、蛋白質(zhì)和DNA等生化物質(zhì)檢測(cè)[4]方面存在大量應(yīng)用。但傳統(tǒng)的SPR檢測(cè)方法難以檢測(cè)超低濃度的生物分子。近年來(lái)，人們開(kāi)始應(yīng)用各種材料如液晶分子、生物素—親和素、納米金、磁納米微球、碳納米管進(jìn)行信號(hào)增強(qiáng)以提高SPR生物傳感器的靈敏度[5]。其中，由于納米金具有高密度、高介電常數(shù)以及高比表面積等優(yōu)點(diǎn)，有利于提高生物識(shí)別分子的固定量，從而極大地增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。

本文利用納米金顆粒和混合巰基自組裝于金膜表面上，研制了一種快速、低檢測(cè)限的SPR生物傳感器，并比較了直接檢測(cè)法與間接檢測(cè)法對(duì)IMA檢測(cè)下限的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 芯片表面預(yù)處理

將50 ℃，體積分?jǐn)?shù)為30 %H2O2∶98 %H2SO4=1∶3的Piranha溶液清洗傳感器金膜表面30 min，再用去離子水清洗3次后，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.2 蛋白質(zhì)的固定

取10 mmol/L MHA(11—巰基十一酸)與MUOH(11—巰基十一醇)混合物(MHA∶MUOH=1∶9)滴于預(yù)處理后的芯片表面，在室溫下避光反應(yīng)24 h，使其表面形成一層巰基自組裝單分子層。然后用酒精沖洗芯片表面，隨后用大量去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?。隨后，將0.1 mol/L NHS和0.4 mol/L EDC等體積混合，取20 μL滴于金膜表面反應(yīng)5 h，交聯(lián)活化金膜，使羧基與氨基交聯(lián)在一起，提高結(jié)合的穩(wěn)定性。取IMA(或抗IMA)20 μL滴于芯片表面反應(yīng)8h后，用去離子水沖洗芯片表面5次，氮?dú)獯蹈?。然后，滴? mol/L,pH=8.5的鹽酸乙醇胺溶液，封閉多余的羧基，以減少結(jié)合過(guò)程中羧基對(duì)IMA(或者抗IMA)的非特異性吸附。最后將制備好的傳感器芯片放于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 IMA—納米金復(fù)合物制備

將IMA與10 nm 納米金顆粒的溶液混合于pH=9的0.1 mol/L的K2CO3溶液中，振蕩4 h，然后在4 ℃下以9 000 r/min轉(zhuǎn)速冷凍離心25 min。移去上清液，沉淀用pH=7.4的PBS稀釋。

1.4 檢測(cè)方法

直接檢測(cè)法：將固定有抗—IMA的傳感器芯片安裝好，然后以20 μL/min通入不同濃度(0～100 mg/L)的IMA溶液，使芯片上的抗IMA與IMA充分結(jié)合。每次測(cè)試完成后需通入pH=13的100 mmol/L NaOH +0.05 % SDS混合溶液進(jìn)行再生，以備下次使用。

抑制檢測(cè)法：不同濃度(0～100 mg/L)的抗IMA與800 mg/L IMA混合后，以20 μL/min流速通入固定有IMA的芯片表面，反應(yīng)3 min，使溶液中的IMA抑制抗體與芯片表面的IMA結(jié)合，接著通入25 mg/L的抗IMA，改變IMA濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。再生方法同上。

IMA—納米金復(fù)合物方法操作同上。不同濃度(0～100 mg/L)的抗IMA與納米金顆粒體積比為0.71的IMA—納米金顆粒混合以后，以20 μL/min通入芯片表面3 min；然后，再通入3 mg/L的抗IMA+不同體積比(0～1)的IMA—納米金顆粒復(fù)合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 IMA特異性對(duì)照實(shí)驗(yàn)

由于人血液中含有肝素、血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物質(zhì)，因此，本實(shí)驗(yàn)首先考察了該方法的特異性來(lái)驗(yàn)證上述物質(zhì)是否會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)配置相同濃度的IMA水溶液和血漿溶液，然后分別通入固定有抗IMA的傳感器進(jìn)行檢測(cè)，SPR響應(yīng)結(jié)果如圖1所示。圖中可以發(fā)現(xiàn)二者的響應(yīng)值非常接近，含相同濃度的IMA水溶液和血漿溶液的SPR響應(yīng)值分別為：1572±96RU和1625±137RU。說(shuō)明血漿中的物質(zhì)幾乎不對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾，即該方法具有很好的特異性。

圖1 IMA水溶液與含相同濃度IMA血漿溶液的SPR響應(yīng)對(duì)比(實(shí)驗(yàn)條件：IMA=100mg/L，采用納米顆粒)

2.2 單一自組裝與混合自組裝芯片比較

本實(shí)驗(yàn)采用裸金芯片，與常用的CM5芯片相比，自組裝裸金芯片少了100 nm糖苷層，使得納米金顆粒與芯片表面更為接近，SPR現(xiàn)象更明顯。同時(shí)，這些糖苷結(jié)構(gòu)會(huì)引起某種空間效應(yīng)，自組裝方法能很好地解決這一問(wèn)題。由于 CM5芯片表面含有羧基，要想把蛋白質(zhì)牢固地連接在芯片表面，須用巰基酸。常用的巰基酸如MUA,MHA等，有文獻(xiàn)報(bào)道巰基醇[6]具有穩(wěn)定作用，常用的巰基醇如MPOH(3—巰基丙醇)，MUOH(11—巰基十一醇),且?guī)€基醇與巰基酸混合對(duì)于蛋白質(zhì)的固定有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。相同碳原子數(shù)的組合占據(jù)蛋白質(zhì)的固定空間，而不同碳原子數(shù)的組合就充分利用了空間高低排布，巰基醇對(duì)蛋白質(zhì)固定不會(huì)造成空間影響。而碳原子數(shù)少的巰基相對(duì)于多的來(lái)說(shuō)，含碳越少越不穩(wěn)定，揮發(fā)性越強(qiáng)，含碳多的巰基在室溫下做實(shí)驗(yàn)有利于保持蛋白質(zhì)活性。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了單獨(dú)采用MUA自組裝和MHA與MUOH混合巰基自組裝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了混合巰基自組裝性能更優(yōu)越(如圖2所示)。Lee E G等人[7]研究表明，這個(gè)組合比例為1∶9時(shí)，對(duì)于蛋白質(zhì)的固定具有最高的SPR響應(yīng)信號(hào)。本文采用的混合比也是1∶9。

圖2 混合自組裝與單一自組裝的SPR響應(yīng)比較(IMA=80 g/L)

2.3 納米金粒子信號(hào)放大作用

納米金顆粒具有量子尺寸效應(yīng)，可以自由給出和獲取電子，同時(shí)，由于其比表面積高，十分有利于提高生物傳感器中生物識(shí)別分子的固定量，進(jìn)而降低檢測(cè)下限。納米金顆粒用于增強(qiáng)生物傳感器的信號(hào)已有許多報(bào)道，但是不同直徑的納米金顆粒對(duì)于信號(hào)放大效果并不完全相同。Fernández F[8]的研究表明：SPR上采用10～20 nm金納米顆粒信號(hào)的增強(qiáng)效果最顯著，所以,本實(shí)驗(yàn)選用直徑為10 nm的納米金顆粒。

圖3為有無(wú)納米金顆粒參與反應(yīng)下的SPR響應(yīng)差異對(duì)比。圖中可以發(fā)現(xiàn)，在相同IMA濃度下，有納米金顆粒參與的反應(yīng)比沒(méi)有納米金顆粒參與的反應(yīng)，其SPR響應(yīng)信號(hào)得到了極大地增強(qiáng)。前者的響應(yīng)信號(hào)比后者提高將近10倍左右。因此，采用納米金顆?？梢允股镔|(zhì)的檢測(cè)限得到明顯的改善。

圖3 加入納米金前后SPR響應(yīng)值比較(IMA=100 mg/L)

2.4 2種檢測(cè)法比較

將IMA固定在芯片表面后，將不同濃度的抗IMA溶液通過(guò)芯片表面將產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)。利用直接檢測(cè)法可以檢測(cè)到372 ng/L。對(duì)于濃度高于393.7 ng/L的IMA，可以直接通過(guò)SPR檢測(cè)，不需要納米金顆粒等的放大作用，直接進(jìn)行檢測(cè)。但對(duì)于濃度低于393.7 ng/L時(shí)，特別是患者剛剛出現(xiàn)心肌缺血時(shí)，血液中IMA含量很低(正常人為0)，直接利用SPR檢測(cè)就很難檢測(cè)到信號(hào)變化，所以，直接法檢測(cè)IMA濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到診斷目的。而抑制法就能很好地解決這個(gè)問(wèn)題。通入不同濃度的IMA或IMA—納米金顆粒復(fù)合物與抗IMA混合溶液。芯片表面固定的IMA越少，抗IMA裸露的位點(diǎn)越多，當(dāng)注入IMA或IMA—納米金顆粒復(fù)合物后，與抗IMA特異性結(jié)合產(chǎn)生的SPR信號(hào)越大。顯然，加入納米金顆粒極大地增強(qiáng)傳感器響應(yīng)信號(hào)，利用抑制法檢測(cè)限小于5.0 ng/L。實(shí)驗(yàn)中分別測(cè)試了不同濃度IMA產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)。

與直接檢測(cè)法相比，抑制檢測(cè)法在低濃度檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。3種情況下批間的變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差/3種物質(zhì)平均值)分別為3.8 %，0.9 %，0.7 %。批內(nèi)的變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差/5個(gè)單獨(dú)檢測(cè)平均值)分別為16.4 %，10.9 %，9.6 %。在自組裝芯片表面，通過(guò)注入IMA溶液，SPR信號(hào)增強(qiáng)了6.1倍，然而，加入納米金以后，SPR信號(hào)增加了9.3倍，極大地改善了檢測(cè)限。直接檢測(cè)時(shí)，芯片表面只通入抗IMA，抗體最低濃度為50 mg/L可得到響應(yīng)信號(hào)，而通入IMA溶液以后，抗體濃度只需25 mg/L,加入納米金顆粒以后，抗體濃度可以低到3 mg/L。3種情況下IMA檢測(cè)限分別為393.7±78，45.3±6.4，5.0±1.6 ng/L。表1給出了2種檢測(cè)的具體數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：通過(guò)這種自組裝納米金方法，得到了更高的靈敏度，有效地增強(qiáng)了響應(yīng)信號(hào)，同時(shí)，極大的降低了檢測(cè)限。

表1 SPR檢測(cè)IMA各項(xiàng)測(cè)試結(jié)果

3 結(jié) 論

SPR生物傳感器與其他方法相比，SPR預(yù)處理簡(jiǎn)單，用時(shí)短，可以同時(shí)測(cè)定多種樣品。但由于儀器費(fèi)用較高，而且IMA固定后要在一個(gè)星期內(nèi)使用才能保持活性，所以,SPR還不是一種廣泛使用的方法。目前本實(shí)驗(yàn)提供的方法還只能在實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)，但從初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，由于該方法具有特異性好、檢測(cè)下限低，以及檢測(cè)耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，因此，對(duì)于心肌缺血的早期診斷具有較好的應(yīng)用前景。

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