杜 娟, 婁新徽, 金慶輝, 趙建龍

(1.中國科學院 上海微系統(tǒng)與信息技術研究所 傳感技術聯(lián)合國家重點實驗室，上海200050；

2.首都師范大學，北京 100048； 3.中國科學院大學，北京100049)

0 引 言

Hg是一種高毒性的全球環(huán)境污染物，由于其具有高遷移性、不可降解性、生物富集性和食物鏈放大性的特點，即便是極微量的存在于環(huán)境中，也會對動植物和人類的健康造成極大的威脅[1, 2]。Hg以多種形式存在于環(huán)境中，水溶性的Hg2+是汞污染最常見和最穩(wěn)定的形式之一。傳統(tǒng)的Hg2+檢測方法主要有：原子吸收法、原子熒光法、高效液相色譜法以及電感耦合等。盡管能夠得到比較精確的檢測結果，但這些技術依賴大型儀器設備、耗費耗時、檢測成本高，很難滿足產(chǎn)地現(xiàn)場快速檢測的要求[3]。隨后又發(fā)展了一些基于有機發(fā)色團[4]、有機熒光小分子[5]以及共軛聚合物[6]的傳感技術，相對于傳統(tǒng)方法，這些方法具有簡單、經(jīng)濟、快速的優(yōu)勢，但是卻有水溶性差、靈敏度低、選擇性局限的缺點。因此，人們迫切需要簡便、快速、經(jīng)濟、準確的Hg2+檢測分析方法。

近年來的研究表明[7, 8]，Hg2+能特異性地與2個胸腺嘧啶堿基(T)共價結合形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結構。基于Hg2+的這一特性，已發(fā)展了各種檢測方法，如納米金比色法[9～14]、熒光分析法[8, 15～21]、電化學法[22～24]等。層析試紙檢測技術是20世紀80年代初發(fā)展起來的一種快速檢測技術，由于其具有快捷、靈敏、成本低廉等顯著優(yōu)點，在快速檢測技術領域中被廣泛應用。本文利用Hg2+與T形成T-Hg2+-T結構的這一特性，以層析試紙為檢測平臺，設計了一種可用于現(xiàn)場快速檢測溶液中Hg2+濃度的檢測試紙條，檢測結果裸眼觀察可見，并可通過金標條閱讀儀進行分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

雙維平面劃膜儀和全自動斬切機(上海金標生物科技公司)；DGG—9053A型恒溫干燥箱(韓國Sumsung公司)；QimageRetiga 2000R數(shù)碼相機(日本Olympus公司)；DJM—4金標條閱讀儀(中國科學院上海光學精密機械研究所)；V—670紫外—可見分光光度計(美國Jasco公司)；JEM—21O0透射電子顯微鏡(TEM，日本電子公司)；Centrifuge5804R高速離心機(德國Eppendorf公司)。

納米金溶液由本實驗室自行制備；金標稀釋液(30 %蔗糖，0.25 %吐溫20，0.25 % SDS，pH=7.2)；MOPS緩沖液(100 mmol/L NaNO3, 10 mmol/L MOPS,pH=7.2)；DNA探針由上海生物工程技術有限公司合成(見表1)；二水合雙(對—磺酰苯基)苯基膦化二鉀鹽(bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphinedihydratedipotassium，BSPP)、三(2—羧乙基)膦鹽酸鹽(Tris(2—carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)、3—嗎啉代丙磺酸(3—(N-morpholino) propanesulfo-nic，MOPS)均購自美國Sigma-Aldrich公司；鏈親和素(美國New England Biolabs公司)；標準汞儲存液(美國AccuStandard公司)；其它試劑為分析純。

層析試紙條材料：結合墊(SB06玻璃纖維)、樣品墊、硝酸纖維素膜(180 s)、吸水墊(CH27吸水紙)和聚氯乙烯(PVC)背板、塑料外殼均購于上?？祆`生物科技公司。

表1 核酸探針序列

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金顆粒的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑約為13 nm的納米金顆粒溶膠。待用玻璃器皿和磁力攪拌子用王水(HCl∶HNO33∶1)浸泡并用去離子水沖洗干凈，置于烘箱內直至干燥。將250 mL的1 mmol/L的四氯金酸(HAuCl4)溶液均勻加熱至沸騰10 min。在高速攪拌下快速加入38.8 mmol/L的檸檬酸三鈉溶液25 mL，繼續(xù)加熱攪拌15 min。停止加熱后繼續(xù)攪拌，自然冷卻至室溫。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納米金探針的標記

將10 mL的13 nm的納米金原液與20 mg BSPP混合，搖床劇烈震動過夜，加入5 mol/L NaNO3直至納米金變成藍色，將混合溶液在25 ℃，13 000 rpm，15 min離心至納米金顆粒完全凝聚，棄上清，加入5 mL的 mg/mL BSPP水溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。? μL的1 mol/LTCEP溶液加入600 μL的5 μmol/L巰基修飾的檢測探針溶液(PB緩沖液)中混合均勻，室溫放置30 min，后加入600 μL制備好的BSPP—納米金溶液，混勻后在4 ℃冰箱內靜止16 h，逐步分次加入1 mol/L NaNO3,10 mmol/L PBS直至最終混合溶液Na+濃度達到150 mmol/L，在4 ℃冰箱內靜止48 h，放入離心機在4 ℃，9 000 rpm，50 min離心，棄上清，加入150 mmol/L NaNO3和10 mmol/L PBS重復洗脫2次，最后儲存于金標稀釋液中。

1.2.3 捕獲探針的制備

將100 μmol/L生物素修飾的捕獲探針溶液(Probe1/2/3)分別與1 g/L鏈親和素等體積混合，室溫靜止1 h后作為捕獲探針備用。

1.2.4 試紙條的制作

用雙維平面劃膜儀將捕獲探針以1 μL/cm的濃度分別固定在NC膜上，間隔為5 mm，作為檢測線T1,T2和控制線C，干燥后封閉備用；用金標稀釋液將納米金探針稀釋后噴涂在結合墊上，37 ℃干燥過夜。在PVC背板上依次粘貼硝酸纖維素膜(NC膜)、結合墊、樣品墊和吸水墊，然后用全自動斬切機切成寬度為3.5 mm的試紙條，壓入塑料外殼中，密封干燥保存。

1.2.5 靈敏度與選擇性測試

在MOPS緩沖液中標準添加Hg2+原液，配置不同濃度的Hg2+溶液，將50μL Hg2+溶液加入試紙條加樣孔，水平靜止5 min，待納米金探針完全由結合墊遷移至吸收墊，即可用觀察條帶顏色變化，然后將試紙條放入DJM—4金標條閱讀儀進一步分析檢測結果。

在MOPS緩沖液中標準添加常見二價重金屬離子，配制Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+溶液用于選擇性測試。

1.2.6 飲用水中的Hg2+檢測

飲用水來源于實驗室，在飲用水中標準添加一定量的Hg2+原液，配制不同濃度的Hg2+溶液，將檢測結果與MOP緩沖液中Hg2+檢測結果對照。

1.2.7 穩(wěn)定性測試

將制備好的試紙條置于室溫放置的干燥器中，分別在第1,2,4,8周取出測定，觀察條帶的顏色和試紙條的靈敏度的變化。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

本研究旨在構建一種靈敏快速的試紙條，用于現(xiàn)場檢測溶液中Hg2+濃度。該試紙主要由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜以及吸收墊四部分組成，包含2條測試線T1,T2和1條控制線C，試紙條結構如圖1(a)所示。探針序列設計見表1。根據(jù)檢測序列，標記在納米金上的AuNP Probe中的一段序列(A20)與測試線T1捕獲探針Probe1完全互補，Probe1為寡核酸鏈T20，對Hg2+具有識別作用。檢測探針另一段序列與控制線C捕獲探針Probe2完全互補，同時與測試線T2捕獲探針Probe2構成對Hg2+具有特異性的識別探針。檢測原理如圖1(b)所示，當待測樣品中無Hg2+存在時，納米金探針被Probe1和Probe3捕獲，T1線和C線顯紅色。當待測樣品中存在Hg2+時，介導T—T錯配形成比A-T穩(wěn)定的T-Hg2+-T結構，Probe1自身形成雙鏈結構而導致捕獲的納米金探針量減少，T1線顏色變淡至消失；Probe2在Hg2+的介導作用下捕獲納米金探針，T2線顯紅色并隨Hg2+濃度提高顏色加深；Probe3捕獲納米金探針不受Hg2+影響，C線始終顯紅色，指示試紙條是否正常工作。

圖1 試紙條結構示意圖和Hg2+檢測原理圖

2.2 納米金探針制備與分析

將制備好的納米金溶液用透射電子顯微鏡(TEM)觀察，其結果如圖2所示，制備的納米金粒子平均粒徑為13±3 nm，大小均勻，形態(tài)穩(wěn)定。

圖2 納米金溶液TEM圖像

納米金原液與納米金探針經(jīng)紫外—可見分光光度計掃描，圖3(a)顯示納米金原液A在520 nm波長附近有最大吸收峰，BSPP納米金(B)最大吸收峰在522 nm處，而標記了單鏈DNA后的納米金探針C最大吸收峰在525 nm處，較原液紅移了約5 nm。圖3(b)所示為瓊脂糖電泳圖，納米金原液A聚集在點樣孔并在電泳液中鹽離子濃度下發(fā)生聚集而變藍；BSPP納米金B(yǎng)穩(wěn)定性增強，未發(fā)生聚集，有明顯條帶；標記了單鏈DNA的納米金探針C由于DNA的牽制導致其電泳速率比BSPP納米金緩慢。綜上所述，單鏈DNA標記納米金探針是成功的。

圖3 紫外—可見吸收譜和瓊脂糖電泳圖

2.3 標準緩沖液中Hg2+檢測結果

用試紙條分別對MOPS緩沖液中濃度為0,0.1,1,10,100 μmol/的Hg2+進行檢測，結果分別如圖4(a)所示，T1線顏色隨Hg2+濃度升高而減弱直至消失，T2線顏色隨Hg2+濃度升高增強，裸眼可見檢測靈敏度約為100 nmol/L。用DJM—4金標條閱讀儀分析檢測結果，以測試線與控制線信號強度比值(T1/C，T2/C)作為衡量標準，繪制曲線如圖4(b)所示，可見該試紙的檢測結果在10 nmol/L～10 μmol/L范圍內具有較好的線性關系。

圖4 試紙條檢測緩沖液中不同濃度Hg2+結果和信號—濃度曲線圖

2.4 對其他重金屬離子的選擇性

用試紙條分別對MOPS緩沖液中1 μmol/L的Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+以及Hg2+進行檢測，檢測結果照片和金標條閱讀儀掃描信號分別如圖5(a)和圖5(b)所示，可見該試紙對常見二價重金屬離子具有良好的選擇性。

圖5 試紙條檢測1 μmol/L Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+,Hg2+結果圖和信號對比

2.5 飲用水中的Hg2+檢測結果

用試紙條分別對飲用水中濃度為0,0.1,1,10,100 μmol/L的Hg2+進行檢測，結果分別如圖6(a)所示。分別取0,1,100 μmol/L飲用水中Hg2+檢測結果與MOPS緩沖液中Hg2+檢測結果對比，金標條閱讀儀器分析結果如圖6(b)所示，檢測結果基本無差別，因此,該試紙可用于飲用水中的Hg2+快速檢測。

圖6 試紙條檢測飲用水中不同濃度Hg2+檢測結果圖和緩沖液與飲用水中Hg2+檢測信號對比圖

2.6 試紙條穩(wěn)定性測試結果

分別在試紙條制備的第1,2,4,8周從干燥箱內取出試紙進行重復實驗，結果表明:在室溫保存8周的試紙條，條帶顏色和檢出限與新制備的試紙條沒有明顯差異，說明在室溫干燥條件下，該試紙條至少可保存2個月。

3 結 論

本文成功研制出一種可用于現(xiàn)場快速檢測的汞離子檢測試紙條，檢測結果在5 min內顯示，裸眼可見靈敏度約為100 nmol/L，金標條閱讀儀分析結果在10 nmol/L～10 μmol/L范圍內具有較好的線性關系，對常見二價重金屬離子具有良好的選擇性。與傳統(tǒng)汞離子檢測方法相比，該方法快捷靈敏、操作簡單、成本低廉、易于存放，在環(huán)境監(jiān)測、食品安全等方面具有很好的應用前景。

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