劉憲華， 石瀟璇， 楊嬌鳳， 米 瑪

(1．天津大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；

2．西藏自治區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，西藏 拉薩 850000)

0 引 言

表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)傳感技術(shù)作為一種生化檢測(cè)方法，可以實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，無(wú)需標(biāo)記待測(cè)物，耗樣量少[1]，但由于SPR生物傳感器設(shè)備體積大，價(jià)格昂貴，對(duì)溫度等實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，真正高精度自動(dòng)化的商業(yè)檢測(cè)裝置難以推廣[2]。局域表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance，LSPR)技術(shù)不僅繼承了SPR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，而且克服了SPR技術(shù)的不足，裝置小型化，成本低廉，受溫度等實(shí)驗(yàn)條件的影響小[3]。LSPR在生物傳感器方面的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注，包括利用膠體聚集的生物傳感器用于蛋白識(shí)別[4]和酶活性探測(cè)[5]以及用于檢測(cè)抗原—抗體識(shí)別[6,7]，激素藥物檢測(cè)[8,9]。透射光譜檢測(cè)方法是LSPR生物傳感器常用的檢測(cè)方法之一，可以直接在比色皿中進(jìn)行檢測(cè)。它的缺點(diǎn)是每次檢測(cè)時(shí)LSPR芯片位置會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。將檢測(cè)池設(shè)計(jì)成為流動(dòng)池，能夠避免檢測(cè)過(guò)程中換樣時(shí)芯片移動(dòng)產(chǎn)生的誤差。但是先制備芯片后檢測(cè)，步驟繁瑣，穩(wěn)定性差的問(wèn)題依然存在。

本文主要是針對(duì)上述LSPR傳感器系統(tǒng)芯片制備過(guò)程繁瑣、制備與檢測(cè)相互孤立等缺點(diǎn)，將電化學(xué)沉積法應(yīng)用于LSPR芯片的制備，設(shè)計(jì)一種操作簡(jiǎn)單、小型化的原位制備LSPR芯片和用于檢測(cè)的一體化的免標(biāo)記LSPR生物傳感器裝置。

1 傳感器的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

1.1 基本原理

LSPR是Au,Ag,Pt等貴金屬納米粒子傳感性質(zhì)的一種光譜表現(xiàn)形式，金屬納米粒子表面大量活躍的自由電子被入射光照射，發(fā)生集體振蕩，當(dāng)入射光頻率與自由電子集體振蕩頻率相當(dāng)時(shí)，產(chǎn)生共振，入射光被強(qiáng)烈吸收，在紫外可見(jiàn)光光譜上表現(xiàn)為出現(xiàn)明顯的特征吸收峰。研究表明，納米粒子的組成、尺寸、形狀和周?chē)橘|(zhì)折射率等因素均會(huì)影響LSPR性質(zhì)[10]。LSPR傳感器即是利用Ag納米粒子的LSPR對(duì)外圍介質(zhì)變化的敏感性制備的。通過(guò)計(jì)算機(jī)采集光譜數(shù)據(jù)，并進(jìn)行處理分析，獲得所需信息，達(dá)到檢測(cè)目的。

1.2 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

原位制備檢測(cè)LSPR生物傳感器分為兩部分:芯片電沉積系統(tǒng);原位檢測(cè)系統(tǒng)(如圖1)。芯片電沉積系統(tǒng)由電化學(xué)工作站組成；原位檢測(cè)系統(tǒng)由光源系統(tǒng)、傳感系統(tǒng)、光譜分析系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，光源系統(tǒng)由氘燈和鎢燈提供紫外光和可見(jiàn)光光源，傳感系統(tǒng)由光學(xué)樣品流動(dòng)池組成，光譜分析系統(tǒng)由光譜儀組成，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)由電腦和相關(guān)處理軟件組成。其中，傳感系統(tǒng)是整個(gè)傳感器的核心部分，也是整合制備和檢測(cè)的關(guān)鍵部分。

圖1 傳感器芯片原位制備與檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖

圖2是傳感系統(tǒng)中光學(xué)樣品流動(dòng)池的半剖結(jié)構(gòu)圖，光纖連接裝置連接光纖和樣品流動(dòng)池，芯片插入芯片插口，覆蓋墊圈，光纖接口裝置在螺紋中緩慢推移芯片，使芯片與墊圈完全接觸密封，樣品池為圓柱形，樣品池的另一端為石英玻璃，整個(gè)樣品池空間密封，在石英片與另一光纖連接裝置之間有一段空白區(qū)域，防止光纖連接裝置擠壓石英片影響密封，另一光纖連接裝置也與光纖相連。樣品由蠕動(dòng)泵勻速進(jìn)樣，從進(jìn)樣口進(jìn)入流動(dòng)池，出樣口流出，進(jìn)樣通道與樣品池下底面相切，Pt絲電極與進(jìn)樣通道相接觸，Pt絲設(shè)計(jì)為螺旋狀，以增加接觸面積。出樣通道與樣品池頂部相切，甘汞電極與出樣口相接觸。另有2個(gè)圓柱形塞子，可在不使用Pt絲電極與甘汞電極時(shí)替代電極，密封樣品池空間。樣品池厚度僅為3 mm，有效地縮短了光程。

圖2 光學(xué)樣品流動(dòng)池半剖結(jié)構(gòu)圖

1.3 系統(tǒng)檢測(cè)

LSPR生物傳感器芯片原位制備檢測(cè)的過(guò)程如圖3所示。一般選擇氧化銦錫(indium tin oxide,ITO)導(dǎo)電玻璃做基底芯片，先以基底芯片在水中的光譜線做參比，然后通入電解液，在一定條件下電沉積法在ITO層表面自組裝納米粒子，并測(cè)得吸光光譜圖，做基準(zhǔn)值。如果只是簡(jiǎn)單地測(cè)周?chē)橘|(zhì)折射率的改變，可直接通入不同折射率的溶液，記錄吸光光譜的變化即可；如果做復(fù)雜的蛋白質(zhì)、DNA、生物小分子等的檢測(cè)，待檢測(cè)物與納米粒子無(wú)法直接作用，則需要進(jìn)一步地修飾LSPR芯片表面來(lái)達(dá)到檢測(cè)的目的。最后由相關(guān)的光譜分析軟件實(shí)時(shí)記錄和分析所得數(shù)據(jù)。整個(gè)過(guò)程制備檢測(cè)一體化，實(shí)時(shí)快速便捷，無(wú)需移動(dòng)，有效地減少了繁瑣的步驟和移動(dòng)帶來(lái)的干擾。

圖3 LSPR生物傳感器芯片原位制備與測(cè)試過(guò)程示意圖

該LSPR生物傳感器也適用于傳統(tǒng)的先制備好芯片后進(jìn)行檢測(cè)，只需使用另外的2個(gè)圓柱形塞子代替Pt絲電極和甘汞電極密封樣品池空間，其余步驟類(lèi)似。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，芯片位置不需要移動(dòng)，同樣地顯示出其原位檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)測(cè)試

2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

本實(shí)驗(yàn)選用ITO層厚度為25±5 nm的ITO導(dǎo)電玻璃。將ITO導(dǎo)電玻璃切割成120 mm×20 mm的長(zhǎng)方形，在丙酮、乙醇、超純水中分別超聲清洗10 min，氮?dú)獯蹈伞⑶逑春玫腎TO導(dǎo)電玻璃安裝在LSPR傳感器裝置中，導(dǎo)電的一面朝向樣品流動(dòng)池。通入含2 mmol/L AgNO3和0.5 mol/L H2SO4的水溶液電解液，Pt絲做對(duì)電極，甘汞電極做參比電極，使用電化學(xué)工作站在一定的電壓下電沉積60 s，制得LSPR芯片，然后依次通入0 %(n=1.333)，10 %(n=1.347 9)，20 %(n=1.363 9)，30 %(n=1.381 1)，40 % (n=1.399 7)和50 % (n=1.420 0)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖溶液(n表示折射率)，記錄其吸光光譜，檢測(cè)其對(duì)于周?chē)橘|(zhì)折射率的敏感度。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

對(duì)ITO導(dǎo)電玻璃在依次在-1.2，-1.4,-1.6 V條件下電化學(xué)沉積60 s，并通入上述不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的蔗糖溶液，得到的吸光光譜。其中在-1.4 V電位下制備的LSPR芯片在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖溶液中的吸光光譜如圖4所示。對(duì)吸光光譜圖進(jìn)行分析，得到峰位移敏感度和吸光度敏感度(表1)。ITO層厚度為23±5 nm的ITO玻璃，在電化學(xué)沉積電位為-1.2 V時(shí)，相對(duì)周?chē)橘|(zhì)折射率的峰位移敏感度為238 nm/RIU，在-1.4，1.6 V時(shí)，峰位移敏感度分別為246，257 nm/RIU。由此可見(jiàn)，在同一ITO厚度層的條件下，當(dāng)電化學(xué)沉積電位在負(fù)方向由1.2 V增大到1.6 V時(shí)，LSPR峰所處波段的紅移相對(duì)于周?chē)凵渎首兓龃?，Ag納米自組裝LSPR芯片對(duì)周?chē)橘|(zhì)折射率響應(yīng)增大。

圖4 ITO導(dǎo)電玻璃在-1.4 V電位下電化學(xué)沉積60 s

LSPR峰的吸光度數(shù)值的變化與周?chē)橘|(zhì)折射率的變化呈線性關(guān)系也表現(xiàn)了電化學(xué)沉積法自組裝的Ag納米LSPR對(duì)于周?chē)橘|(zhì)折射率的響應(yīng)。ITO層厚度為23±5 nm的ITO玻璃，電化學(xué)沉積電位在負(fù)方向依次增大時(shí)，LSPR峰的吸光度數(shù)值相對(duì)周?chē)橘|(zhì)折射率的敏感度分別為-0.58，-0.65，-0.32 nm/a。電化學(xué)沉積電位為-1.4 V時(shí)，吸光度靈敏度最高。厚度為23±5 nm的ITO玻璃，電化學(xué)沉積電位為-1.4 V時(shí)，表現(xiàn)出的246 nm/RIU的折射率靈敏度比已報(bào)道的Ag納米球的折射率靈敏度要高[11]，此條件下所制得的LSPR芯片性能最好。

表1 ITO玻璃在不同電化學(xué)沉積電位下自組裝的LSPR芯片相對(duì)于周?chē)橘|(zhì)折射率的峰位移敏感度和吸光度敏感度

3 結(jié) 論

本文與電化學(xué)法相結(jié)合，設(shè)計(jì)了芯片制備和檢測(cè)一體化的LSPR生物傳感器。該裝置具有小型化、易操作、檢測(cè)結(jié)果實(shí)時(shí)化等特點(diǎn)，具有廣闊的商業(yè)化前景。研究了不同電化學(xué)沉積電位對(duì)自組裝Ag納米粒子LSPR芯片的影響，厚度為23±5 nm的ITO玻璃，電化學(xué)沉積電位為-1.4 V時(shí)，制得的LSPR芯片折射率靈敏度為246 nm/RIU，高于已報(bào)道的Ag納米球折射率靈敏度。

參考文獻(xiàn):

[1]張建碧.基于MEMS的硅微壓阻式加速度傳感器設(shè)計(jì)[J].電子與封裝,2009,9(10):39-41.

[2]曾祥華,楊 軍,田 浩,等.一種小型化SPR生物傳感器的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[J].傳感器與微系統(tǒng),2013,32(4):109-112.

[3]張曉鋒.LSPR生物傳感器的制備與測(cè)試[D].天津:南開(kāi)大學(xué),2011.

[4]Wang Zhenxin,Le’vy R,Fernig D G,et al.Kinase-Catalyzed modification of gold nanoparticles:A new approach to colorimetric kinase activity screening[J].Journal of American Chemical So-ciety,2006,128(7):2214-2215.

[5]Nath N,Chilkoti A.A colorimetric gold nanoparticle sensor to interrogate biomolecular interactions in real time on a surface[J].Analytical Chemistry,2002,74(3):504-509.

[6]Frederix F,Friedt J M,Choi K H,et al.Biosensing based on light absorption of nanoscaled gold and silver particles[J].Analytical Chemistry,2003,75(24):6894-6900.

[7]Kreuzer M P,Quidant R,Badenes G,et al.Quantitative detection of doping substances by a localised surface plasmon sensor[J].Biosensors and Bioelectronics,2006(21):1345-1349.

[8]Kreuzer M P,Quidant R,Salvador J P,et al.Colloidal-based localized surface plasmon resonance(LSPR)biosensor for the quantitative determination of stanozolol[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008,391(5):1813-1820.

[9]Lee K S,El-Sayed M A.Gold and silver nanoparticles in sensing and imaging:Sensitivity of plasmon pesponse to size, shape, and metal composition[J].Journal of Physical Chemistry B,2006,110(39):19220-19225.

[10] Doremus R H.Optical properties of small silver particles[J].The Journal of Chemical Physics,1965,42(1):414-416.

[11] Mock J J,Smith D R,Schultz S.Local refractive index dependence of plasmon resonance spectra from individual nanoparticle-s[J].Nano Letters,2003,3(4):485-491.