陳 偉 林映才 馬現(xiàn)永 蔣宗勇 余德謙

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，畜禽育種國家重點實驗室，廣州 510640)

大豆異黃酮主要由大豆苷元、染料木素、黃豆黃素3種物質(zhì)構(gòu)成，由于其具有抗氧化、改善免疫等生物學特性，因而被廣泛應用于人類醫(yī)學/營養(yǎng)和動物生產(chǎn)中。異黃酮在化學結(jié)構(gòu)上含有多酚羥基，羥基上的氫原子具有較強的還原活性而使得異黃酮發(fā)揮抗氧化作用。體外分析發(fā)現(xiàn)，異黃酮比抗氧化劑-抗壞血酸和槲皮素具有更強的抗氧化活性［1］。由此可見，異黃酮能通過清掃機體中活性氧(如羥自由基與超氧陰離子)而發(fā)揮抗氧化活性［2-3］。體外試驗證實，通過預處理染料木素能保護精子DNA免受氧化損傷［4］。動物試驗亦發(fā)現(xiàn)，小鼠純合飼糧中添加0.2%大豆異黃酮，飼喂達5周后，能夠增強小鼠抗氧化性能并能防止脂質(zhì)過氧化［5］。本研究小組證實，在飼糧中添加低水平的異黃酮(40 mg/kg)對動物機體抗氧化能夠起促進作用［6］。然而飼糧高水平添加異黃酮對動物抗氧化等生物學功能的影響尚不清楚。本研究旨在探討飼糧異黃酮添加水平對肥育豬的抗氧化、生長及屠體性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取健康、平均體重約為60 kg的72頭杜×長×大生長豬(閹公豬和母豬各占1/2)，按體重一致原則隨機分為6組，每組6個重復，每個重復中1頭閹公豬和1頭母豬，1個重復在1欄中飼養(yǎng)。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧，為參照NRC(1998)［7］營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗組飼喂在基礎飼糧中分別添加 20、40、80、160、320 mg/kg 異黃酮的試驗飼糧。試驗期64 d。異黃酮(主要成分為大豆苷元)由廣東農(nóng)科院動物科學研究所新南都飼料科技有限公司合成(純度99%)。

1.2 動物飼養(yǎng)及樣品采集

試驗動物每天分別于09:00與16:00共飼喂2次，試驗期間試驗豬自由采食、飲水。試驗結(jié)束時，于各組選取體重接近的閹公豬和母豬各3頭，空腹12 h后，頸靜脈采集抗凝血液(10 mL)，3 000 r/min 4℃離心10 min后分裝血漿，-20℃凍存待測。采集血液后，電暈豬放血致死，并屠宰，迅速采集肝臟樣品后，對屠體劈半后進行屠體性能和肉質(zhì)測定。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能測定

試驗開始前和試驗結(jié)束時，試驗豬空腹12 h稱重，為初重和末重，根據(jù)試驗天數(shù)計算平均日增重、日均采食量和料重比。

1.3.2 屠體性能及肉質(zhì)測定

屠體重/率、平均背膘厚、瘦肉重/率、脂肪重/率、眼肌面積、pH及嫩度測定參考 NY/T 825—2004［8］。所有測定工作在廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所屠宰間測定室進行。

1.3.3 血漿生化指標

血漿中抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)、超氧化物岐化酶(SOD)活性以及氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)濃度均采用試劑盒(南京建成生物研究所)測定。肝臟中抗氧化酶CAT、Gpx、SOD活性及MDA濃度測定采用生理鹽水勻漿肝臟組織后4℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液根據(jù)試劑盒說明測定酶活性，采用雙金雞寧酸(BCA)法測定上清液蛋白質(zhì)濃度。

1.3.4 氧化平衡系數(shù)(PAB value)的測定

血漿與肝臟中氧化平衡系數(shù)測定參考Alamdari等［9］的方法。

制劑配制:1)標準液，3 mmol/L尿酸(溶解在10 mmol/L氫氧化鈉)代表抗氧化劑，250 μmol/L過氧化氫(H2O2)代表氧化劑，2種物質(zhì)混合比例分別為 v∶v=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9;2)甲基聯(lián)苯胺(TMB)堿性溶液，400 μL TMB/二甲基亞砜(DMSO)(60 mg TMB溶解在10 mL DMSO)加到20 mL乙酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.5)中，并加入70 μL 新鮮氯胺T(100 mmol/L)，混勻，室溫避光2 h，隨后加入25 U的過氧化物酶溶液到20 mL TMB溶液中(若長久使用，分裝-20℃保存);3)TMB緩沖溶液，200 μL TMB/DMSO加入到10 mL乙酸鈉緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 5.8)。4)工作液(隨用隨配)，1 mL TMB堿性溶液+10 mL TMB緩沖溶液，室溫下避光孵育2 h(要求立即使用)。

測定操作方法:10 μL標準液加入200 μL工作液中，隨即在37℃下避光孵育12 min，孵育后加入100 μL 2 mol/L鹽酸，同時設空白對照(雙蒸水)。并在450 nm下讀數(shù)(參考波長 620或570 nm)。根據(jù)標準液濃度做標準曲線，計算檢測液中的氧化平衡系數(shù)。氧化平衡系數(shù)表示檢測液中H2O2的百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件GLM程序進行單因素方差(ANOVA)分析。并在ANOVA分析基礎上進行Duncan氏法多重比較，P＜0.05表示差異顯著。本試驗數(shù)據(jù)采用REG程序?qū)Ω髦笜说膭┝啃鼍€性和二次曲線分析。

2 結(jié)果與分析

由表2可見，肥育豬血漿中SOD活性隨飼糧中異黃酮添加水平增加表現(xiàn)出顯著的線性升高(P＜0.05)，而各組間血漿中SOD活性無顯著差異(P＞0.05)。飼糧異黃酮添加水平為160 mg/kg時，顯著提高了血漿中CAT活性(P＜0.05)，但其他異黃酮添加水平對血漿中CAT活性無顯著影響(P＞0.05)。血漿中GSSG濃度在添加水平為40及80 mg/kg時顯著下降(P＜0.05)，而 GSH 濃度在添加水平為 40、80、160、320 mg/kg時較對照組顯著上升(P＜0.05)。各組間血漿中T-AOC、氧化平衡系數(shù)及Gpx活性無顯著差異(P＞0.05)，但當添加水平為320 mg/kg時，血漿中氧化平衡系數(shù)表現(xiàn)出高于對照組的趨勢(P=0.08)。

表2 飼糧異黃酮添加水平對肥育豬血漿中抗氧化酶活性影響Table 2 Effects of dietary supplemental level of isoflavones on antioxidant enzyme activities in plasma of finishing pigs

由表3可見，肝臟中Gpx活性隨飼糧異黃酮添加水平增加呈顯著的線性下降(P＜0.05)，在添加水平為80、160和320 mg/kg時，肝臟中Gpx活性顯著低于對照組(P＜0.05)。肝臟中CAT活性在添加80 mg/kg異黃酮時得到顯著提高(P＜0.05)，而在160 mg/kg時則受到顯著抑制(P＜0.05)。肝臟中T-AOC、SOD以及氧化平衡系數(shù)于各組間無顯著差異(P＞0.05)。

表3 飼糧異黃酮添加水平對肥育豬肝臟中抗氧化酶活性影響Table 3 Effects of dietary supplemental level of isoflavones on antioxidant enzyme activities in liver of finishing pigs

由表4可見，當飼糧中異黃酮添加水平為80或160 mg/kg時，肥育豬血漿中MDA濃度顯著低于對照組(P＜0.05)，而其他各添加水平間血漿MDA濃度無顯著差異(P＞0.05)。肝臟中MDA濃度各組間均無顯著差異(P＞0.05)。

表4 飼糧異黃酮添加水平對肥育豬肝臟脂質(zhì)過氧化的影響Table 4 Effects of dietary supplemental level of isoflavones on lipid perioxidation liver of finishing pigs

飼糧異黃酮添加水平對肥育豬的平均日增重、日均采食量、料重比無顯著影響(P＞0.05，表5)，對屠體重/率、眼肌面積、平均背膘厚、瘦肉重/率、脂肪重/率等屠體性能無顯著影響(P＞0.05，表6)，對背最長肌滴水損失、肉色、嫩度、pH無顯著影響(P＞0.05，表7)。

表5 飼糧異黃酮添加水平對肥育豬生長性能影響Table 5 Effects of dietary supplemental level of isoflavones on growth performance of finishing pigs

3 討論

3.1 異黃酮與抗氧化

大豆異黃酮主要由染料木素與大豆苷元組成，在大豆(1 429～4 875 mg/kg)與豆粕(1 570～1944 mg/kg)中含量較高［10-11］。本試驗采用玉米-豆粕型飼糧作為基礎飼糧，因而與其他試驗有所不同的是，本試驗基礎飼糧中含有較高水平的異黃酮(約390 mg/kg)。在此基礎上，添加80或160 mg/kg異黃酮提高了肥育豬血漿中抗氧化酶活性與GSH濃度，同時降低了MDA濃度。該結(jié)果提示，飼糧中80和160 mg/kg異黃酮提高了機體抗氧化能力，并降低了機體中脂質(zhì)過氧化。與本試驗研究結(jié)果相一致的報道是，對飼喂非大豆來源的基礎飼糧的小鼠灌服異黃酮(每200 g體重灌服1 mg大豆黃酮)能提高血漿與血紅細胞中抗氧化酶活性［12］，從而表現(xiàn)為抗氧化作用。體外細胞試驗還發(fā)現(xiàn)，由于異黃酮的結(jié)構(gòu)與雌激素相似，因而異黃酮能激活細胞內(nèi)參與基因轉(zhuǎn)錄的重要激酶［13-15］，并能抑制由還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶所介導的超氧陰離子的生成［16］，從而抑制了促氧化酶途徑。由此可見，異黃酮不僅依賴自身結(jié)構(gòu)(具有還原活性的羥基)參與機體中自由基的清除，而且還可通過調(diào)節(jié)機體中抗/促氧化酶的活性起到抗氧化作用。

表6 飼糧異黃酮添加水平對肥育豬屠體性能影響Table 6 Effects of dietary supplemental level of isoflavones on carcass performance of finishing pigs

表7 飼糧異黃酮添加水平對肥育豬肉質(zhì)的影響Table 7 Effects of dietary supplemental level of isoflavones on meat quality of finishing pigs

3.2 高水平異黃酮對抗氧化的潛在抑制效應

本研究還發(fā)現(xiàn)，與異黃酮提高抗氧化酶相反的結(jié)果是，添加160 mg/kg異黃酮顯著降低肝臟中CAT活性;同時肝臟中Gpx活性與T-AOC隨著異黃酮添加水平的增加而呈線性降低。雖然80 mg/kg異黃酮相比對照顯著降低了MDA濃度，但當添加水平達到320 mg/kg時，血漿中MDA濃度顯著高于添加水平為80 mg/kg時。這暗示著飼糧中添加過高水平異黃酮可能對肥育豬表現(xiàn)為抗氧化抑制效應。由于異黃酮在化學結(jié)構(gòu)上與雌激素具有相似性，其對抗氧化酶的調(diào)節(jié)一定程度上依賴于異黃酮與雌激素受體的互作。研究報道，異黃酮在生理濃度條件下，可通過雌激素受體上調(diào)細胞中抗氧化酶錳超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA表達，而表現(xiàn)出抗氧化效應［17］。然而在較高水平(240 mg/kg)條件下，異黃酮對雌激素受體所介導的生物學效應則表現(xiàn)為抑制效應［18］。由此可見，高水平異黃酮可能通過作用于雌激素受體抑制抗氧化酶表達水平。除下調(diào)抗氧化酶活性外，高水平異黃酮還可能通過激活促氧化途徑影響細胞氧化還原平衡。體外細胞試驗表明，飼糧中含有酚環(huán)的多酚類物質(zhì)可氧化人紅細胞中血紅蛋白，并造成溶血現(xiàn)象［19］。體外研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)染料木素能通過結(jié)合內(nèi)源銅離子，激活促氧化信號通路［20］或誘導細胞中活性氧的生成，促進細胞凋亡［21］。

在其他抗氧化劑研究中亦發(fā)現(xiàn)，當較長時間使用高水平的抗氧化劑可引起細胞脂類過氧化，并減弱抗氧化酶的活性，這些抗氧化劑包括維生素 E［22］、維生素 C［23-24］、類胡蘿卜素［25］、α - 硫辛酸［26］。綜合各項研究報道，一些天然抗氧化劑(尤其是含有酚環(huán)類結(jié)構(gòu)物質(zhì))不僅具有抗氧化活性，在一些條件下(如高水平)也可能產(chǎn)生促氧化特性［27］。

3.3 異黃酮對肥育豬生長及屠體性能影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，玉米-豆粕型飼糧異黃酮添加水平對肥育豬生長性能和屠體品質(zhì)沒有產(chǎn)生影響，該研究結(jié)果與 Kuhn等［28］研究報道相一致。因此可見，即使在表現(xiàn)為抗氧化活性的異黃酮水平(80或160 mg/kg)基礎上，也未能對肥育豬的生長起到積極的促進作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，玉米-豆粕型飼糧中添加40～320 mg/kg不等水平的異黃酮對背最長肌pH、肉色、滴水損失、嫩度等肉質(zhì)指標均未產(chǎn)生顯著影響。

4 結(jié)論

①飼糧中添加80或160 mg/kg的異黃酮可提高肥育豬機體抗氧化性能，并減少脂質(zhì)過氧化。

②飼糧異黃酮添加水平高達320 mg/kg時，對肥育豬肝臟組織抗氧化能力表現(xiàn)出潛在的抑制效應。

③玉米-豆粕型飼糧中添加40～320 mg/kg異黃酮對肥育豬生長、屠體性狀及肉質(zhì)無顯著影響。

［1］R?FER C E，KULLING S E.Antioxidant activity of isoflavone and their major metabolites using different in vitro assays［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(8):2926-2931.

［2］HANASAKI Y，OGAWA S，F(xiàn)UKUI S.The correlation between active oxygen scavenging and antioxidative effects of flavonoids［J］.Free Radical Biology ＆Medicine，1994，16(6):845-850.

［3］ROBAK J，GRYGLEWSKI R J.Flavonoids as scavengers of superoxide anions［J］.Biochemical Pharmacology，1988，37(5):837-841.

［4］SIERENS J，HARTLEY J A，CAMPBELL J，et al.In vitro isoflavone supplementation reduces hydrogen peroxide-induced DNA damage in sperm［J］.Teratogenesis，Carcinogenesis，and Mutagenesis，2002，22(3):227-234.

［5］KAWAKAMI Y，TSURUGASAKI W，YOSHIDA Y，et al.Regulative actions of dietary soy isoflavone on biological antioxidative system and lipid metabolism in rats［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(6):1764-1768.

［6］JIANG Z Y，JIANG S Q，LIN Y C，et al.Effects of soybean isoflavone on growth performance，meat quality，and antioxidation in male broilers［J］.Poultry Science，2007，86(7):1356-1362.

［7］NRC.Nutrient requirements of swine［S］.Washington，D.C.:National Academy Press，1998.

［8］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 825—2004瘦肉型豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范［S］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004:1-2.

［9］ALAMDARI D H，PALETAS K，PEGIOU T，et al.A novel assay for the evaluation of the prooxidant-antioixdant balance，before and after antioxidant vitamin administration in type Ⅱ diabetes patients［J］.Clinical Biochemistry，2007，40(3/4):248-254.

［10］CHINWANGSO P，ANAI T，MATSUMOTO R.The diversity of isoflavone contents and in vitro antioxidant activities in Japanese soybean(Glycine mx(L.)Merr.)cultivars［J］.Bulletin of the Faculty of Agriculture，2010，95:17-28.

［11］FLACHOWSKY G，HüNERBERG M，MEYER U，et al.Isoflavone concentration of soybean meal from various origins and transfer of isoflavones into milk of dairy cows［J］.Journal of Verbraucherschutz and Lebensmittelsicherheit，2011，6(4):449-456.

［12］BARBOSA A C，LAJOLO F M，GENOVESE M I.Effects of free or protein-associated soy isoflavones on the antioxidant status in rats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91(4):721-731.

［13］MAHN K，BORRáS C，KNOCK G A，et al.Dietary soy isoflavone induced increases in antioxidant and eNOS gene expression lead to improved endothelial function and reduced blood pressure［J］.The FASEB Journal，2005，19(12):1755-1757.

［14］JOY S，SIOW R C，ROWLANDS D J，et al.The isoflavone equol mediates rapid vascular relaxation:Ca2+-independent activation of endothelial nitric-oxide synthase/Hsp90 involving ERK1/2 and Akt phosphorylation in human endothelial cells［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，281(37):27335-27345.

［15］SIOW R C，LI F Y，ROWLANDS D J，et al.Cardiovascular targets for estrogens and phytoestrogens:transcriptional regulation of nitric oxide synthase and antioxidant defense genes［J］.Free Radical Biology ＆Medicine，2007，42(7):909-925.

［16］XU J W，IKEDA K，YAMORI Y.Genistein inhibits expressions of NADPH oxidase p22phox and angiotensinⅡtype 1 receptor in aortic endothelial cells from stroke-prone spontaneously hypertensive rats［J］.Hypertension Research，2004，27(9):675-683.

［17］BORRáS C，GAMBINI J，GóMEZ-CABRERA M C.et al.Genistein，a soy isoflavone，up-regulates expression of antioxidant genes:involvement of estrogen receptor，ERK1/2，and NFκB［J］.The FASEB Journal，2006，20(12):1476-1481.

［18］WOOD C E，REGISTER T C，F(xiàn)RANKE A A，et al.Dietary soyisoflavones inhibit estrogen effects in the postmenopausal breast［J］.Cancer Research，2006，66(2):1241-1249.

［19］GALATI G，SABZEVARI O，WILSON J，et al.Prooxidant activity and cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics［J］.Toxicology，2002，177(1):91-104.

［20］ULLAH M F，AHMAD A，ZUBAIR H，et al.Soy isoflavone genistein induces cell death in breast cancer cells through mobilization of endogenous copper ions and generation of reactive oxygen species［J］.Molecular Nutrition and Food Research，2011，55(4):553-559.

［21］LEE Y K，PARK O J.Soybean isofalvone genistein regulates apoptosis through NF-κB dependent and independent pathways［J］.Experimental and Toxicologic Pathology，2013，65(1/2):1-6.

［22］HAJIANI M，GOLESTANI A，SHARIFTABRIZI A，et al.Dose-depedent modulation of systemic lipid peroxidation and activity of ani-oxidant enzymes by vitamin E in the rat［J］.Redox Report，2008，13(2):60-66.

［23］PODMORE I D，GRIFFITHS H R，HERBERT K E，et al.Vitamin C exhibits pro-oxidant properties［J］.Nature，1998，392:559-559.

［24］馬愛國，劉四朝.不同劑量維生素C對DNA氧化損傷影響的研究［J］.營養(yǎng)學報，2001，23(1):12-14.

［25］宋雁，盧承前，陳君石.類胡蘿卜素抗氧化和促氧化作用的影響因素［J］.衛(wèi)生研究，2003，32(4):417-419.

［26］BHATTI F，MANKHEY R W，ASICO L，et al.Mechanism of antioxidant and pro-oxidant effects of α-lipoic acid in the diabetic and nondiabetic kidney［J］.Kidney International，2005，67(4):1371-1380.

［27］陳偉，林映才，馬現(xiàn)永，等.一些抗氧化劑的促氧化作用機制［J］.動物營養(yǎng)學報，2012，24(4):595-605.

［28］KUHN G，HENNING U，KALBE C，et al.Growth performance，carcass characteristics and bioavailability isoflavones in pigs fed soy bean based diets［J］.Archives of Animal Nutrition，2004，58(4):265-276.