趙 建,黃建國(guó),*,袁 玲, 時(shí)安東,杜如萬(wàn),刑小軍

(1. 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716； 2. 四川省涼山州煙草公司，西昌 615000)

隨著我國(guó)城市規(guī)模的不斷擴(kuò)張，菜地資源日益減少，蔬菜連作現(xiàn)象十分普遍，病害發(fā)生嚴(yán)重。番茄灰霉病是由灰葡萄孢BotrytiscinereaPers. 侵染引起的真菌病害，發(fā)病面積大、危害嚴(yán)重，番茄產(chǎn)量損失可達(dá)30%以上[1- 2]。目前，生產(chǎn)中缺乏高抗灰霉病的番茄品種[3]，病害防治一直依賴化學(xué)藥劑，但長(zhǎng)期連續(xù)施用導(dǎo)致灰葡萄孢容易產(chǎn)生抗藥性，常用的多菌靈、甲基硫菌靈、苯菌靈等苯并咪唑類等農(nóng)藥的防治效果已顯著降低。此外，大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅影響番茄果實(shí)的安全性，危害人體健康，而且還造成嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[4- 5]。所以，研制高效、穩(wěn)定、安全的生物農(nóng)藥，防治番茄灰霉病很有必要。

寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)屬卵菌門(mén)(Heterokontophyta)，腐霉科(Pythiaceae)，腐霉屬(Pythium)，能有效抑制灰葡萄孢Botrytiscinerea、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum和黑脛病菌Phytophthoranicotiana等多種植物病原真菌的生長(zhǎng)繁殖[6]。研究表明，寡雄腐霉抑菌的主要機(jī)理是寄生、抗生和競(jìng)爭(zhēng)等作用[7]，田間單獨(dú)接種寡雄腐霉還能誘導(dǎo)植物抗病性[8]，促進(jìn)植物生理代謝和刺激生長(zhǎng)[9]。目前，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家已制備出對(duì)人畜無(wú)毒安全，無(wú)環(huán)境殘留的寡雄腐霉卵孢子制劑，用于蔬果的生產(chǎn)與保鮮[10- 11]。但是，在大田應(yīng)用孢子活菌劑時(shí)，生防效果依賴于卵孢子的萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)繁殖，常受溫度、濕度、光照(尤其是紫外線強(qiáng)度)、降雨、土壤、農(nóng)藝(施肥、耕作、化學(xué)農(nóng)藥)等多種自然或人為因素的影響，故防病效果不佳，穩(wěn)定性差[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，寡雄腐霉能產(chǎn)生寡雄蛋白和抗菌物質(zhì)等多種次生代謝物[6]。因此，直接利用寡雄腐霉的次生代謝產(chǎn)物可避免人為和環(huán)境因素對(duì)活菌生長(zhǎng)繁殖和分泌次生代謝產(chǎn)物的影響，既可提高防病效果，又能克服微生物活體菌劑效果不穩(wěn)定的常見(jiàn)缺陷。為此，本研究利用自主分離獲得的寡雄腐霉優(yōu)良菌株，制備發(fā)酵液，研究該發(fā)酵液對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響和對(duì)灰霉病的防治作用，并在大田生產(chǎn)中進(jìn)行生防效果驗(yàn)證，旨在為研發(fā)防效好而穩(wěn)定的番茄灰霉病生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為佳粉15號(hào)；番茄灰霉病菌由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供；寡雄腐霉發(fā)酵菌株P(guān).oligandrumCQ2010(PoCQ2010)從種植番茄的土壤中自主分離獲得，保存于西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。取60 g玉米粉，80 ℃水浴2 h，過(guò)濾，濾液加15 g葡萄糖，定容至1 L，pH值調(diào)至6.0，1000 mL三角瓶裝液量500 mL，滅菌得玉米汁培養(yǎng)液，然后接種寡雄腐霉菌株，搖床培養(yǎng)7 d，(301) ℃、150 r/min，用200m的濾膜真空抽濾制備寡雄腐霉發(fā)酵液，-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。預(yù)備試驗(yàn)中，寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)78.6%，對(duì)灰霉病菌的孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)51.2%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

盆栽試驗(yàn)于2011年3月2日至7月10日在西南大學(xué)溫室盆栽場(chǎng)進(jìn)行。在番茄生長(zhǎng)季節(jié)，采集重慶市典型、具有代表性的灰棕紫泥紫色土耕作層(0—20 cm)。土壤基本理化性質(zhì)：質(zhì)地中壤，pH值7.1，有機(jī)質(zhì)10.79 g/kg，全氮0.78 g/kg，全磷0.42 g/kg，全鉀20.54 g/kg，堿解氮28.34 mg/kg，有效磷10.91 mg/kg，有效鉀153.2 mg/kg。將揀去石礫和植株殘?bào)w等雜物的土壤晾干，高壓蒸汽滅菌后備用。播種前每盆裝土2.5 kg，以硝酸銨、過(guò)磷酸鈣和硫酸鉀作基肥，每千克土壤分別施入氮 200 mg、磷 100 mg、鉀200 mg。

每盆移栽株高10 cm 左右的番茄幼苗2株，常規(guī)栽培20 d。選擇60盆長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄植株進(jìn)行試驗(yàn)處理，每組30盆，一組接種灰霉病菌，用B.C表示；另一組不接種灰霉病菌(對(duì)照)，用CK表示。在多云無(wú)風(fēng)的天氣條件下：①每組各取15盆，噴施高溫滅菌的培養(yǎng)液，以葉面上附有細(xì)密液滴但不流淌為宜，簡(jiǎn)稱“培養(yǎng)液”，用A表示；②另15盆用寡雄腐霉發(fā)酵液噴施，簡(jiǎn)稱“發(fā)酵液”，用B表示。噴施24 h后，對(duì)B.C組采用毛筆涂抹法接種灰霉病菌(孢子濃度約為1×105個(gè)CFU/mL)，保濕48 h[13]。由此形成整4個(gè)處理：①接病菌+培養(yǎng)液(B.C +A)；②接病菌+發(fā)酵液(B.C+B)；③不接病菌+培養(yǎng)液(CK +A)；④不接病菌+發(fā)酵液(CK+B)。按盆栽試驗(yàn)的常規(guī)方法，澆水、除草等管理番茄幼苗。

田間試驗(yàn)于2012年3月12日至7月10日在重慶市北碚區(qū)璧山縣番茄種植基地日光溫室中進(jìn)行，以具有代表性的灰棕紫泥為供試土壤，田間種植當(dāng)?shù)氐闹髟苑哑贩N(約2000 株)，研究了寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)灰霉病的防治作用。試驗(yàn)設(shè)置3種處理：①寡雄腐霉發(fā)酵液(T1)；②化學(xué)農(nóng)藥腐霉利(T2)；③清水(CK)，施藥間隔期30 d(3月至7月)，施藥量800 L/hm2，每處理重復(fù)3次，每個(gè)處理小區(qū)面積38.95 m2約200株，隨機(jī)區(qū)組排列，并常規(guī)管理大田番茄植株。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響

盆栽試驗(yàn)處理后35 d，收獲番茄植株。先稱取生物量，再隨機(jī)選10個(gè)成熟功能型葉片，用打孔器取樣，丙酮提取-分光光度法測(cè)定葉綠素含量[14]，并選取新鮮須根，用TTC法測(cè)定根系活力[14]。然后，將植株105 ℃殺青后(80±2) ℃烘干，常規(guī)分析氮、磷、鉀含量[15]。

1.3.2寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的防治效果

盆栽試驗(yàn)中，處理后第10天調(diào)查、統(tǒng)計(jì)番茄植株發(fā)病率和病情指數(shù)；大田試驗(yàn)中，調(diào)查各個(gè)小區(qū)最后一次施藥10 d后灰霉病引起的病果率，計(jì)算防治效果。番茄灰霉病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及藥效計(jì)算方法按照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行[16]。

1.3.3 番茄葉片病理指標(biāo)測(cè)定

盆栽試驗(yàn)處理后第1、4、7、10、13天，分別隨機(jī)選取5個(gè)成熟功能型葉片，用打孔器取樣，電導(dǎo)法測(cè)定細(xì)胞膜透性[17]，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量[18]。并在第10天采集樣葉，稱取0.5 g，加石英砂和PBS 溶液(pH值7.8)冰浴勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心，收集上清液。測(cè)定超氧化物歧化酶活性(SOD)和苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)[19]；多酚氧化酶活性(PPO)[20]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS v6.50統(tǒng)計(jì)軟件處理，并采用LSD法檢測(cè)處理間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的影響

2.1.1 生物量

圖1可見(jiàn)，盆栽試驗(yàn)中，在不接種病菌的條件下，施用寡雄腐霉發(fā)酵液顯著促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)，總生物量提高了9.5%。其中，地上部生物量分別為34.29 g/株(對(duì)照)、36.64 g/株(發(fā)酵液)，提高了6.9%；根系生物量分別為15.05 g/株(對(duì)照)、17.37 g/株(發(fā)酵液)，提高了15.4%。

圖1 番茄植株生物量

2.1.2 葉綠素含量和根系活力

從圖2中可以看出，盆栽試驗(yàn)中，在不接種病菌的條件下，施用發(fā)酵液的處理葉綠素含量最高為1.18 mg/g，比施用培養(yǎng)液的處理顯著提高了21.6%，根系活力比施用培養(yǎng)液的處理也提高了14.4%。但是，在接種病菌的條件下，施用發(fā)酵液對(duì)葉綠素含量和根系活力沒(méi)有顯著影響。

2.1.3 植株養(yǎng)分含量與吸收量

由表1可知，盆栽試驗(yàn)中，在不接種病菌的條件下，施用寡雄腐霉發(fā)酵液促進(jìn)番茄植株吸收養(yǎng)分，氮、磷、鉀吸收量分別增加了8.0%，12.3%，13.6%；在接種病菌的條件下，施用發(fā)酵液顯著提高番茄植株吸收氮素，但對(duì)磷、鉀吸收量無(wú)顯著影響。

圖2 番茄葉片葉綠素含量與根系活力

表1 不同試驗(yàn)處理對(duì)番茄植株的養(yǎng)分含量與吸收量的影響

2.2 寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的防治效果

從表2可知，盆栽試驗(yàn)中，在不接種病菌的處理中，番茄植株未發(fā)生灰霉病。在接種病菌的處理中，施用培養(yǎng)液的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為75.7%和43.3；施用寡雄腐霉發(fā)酵液的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為32.4%和17.2，發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低了57.2%和60.3%，相對(duì)防治效果達(dá)到60.3%。大田試驗(yàn)中，施用寡雄腐霉發(fā)酵液的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為29.8%和11.3，發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低了59.0%和71.2%，相對(duì)防治效果達(dá)到71.2%。

表2 寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的防治效果

2.3 寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄植株病理指標(biāo)的影響

2.3.1 細(xì)胞膜透性和丙二醛含量

圖3可見(jiàn)，盆栽試驗(yàn)中，接種病菌顯著提高番茄葉片細(xì)胞膜透性，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其平均值分別為31.0%(接種后第4天)、40.2%(接種后第7天)、47.0%(接種后第10 天)、53.4%(接種后第13天)，但是，在不接種病原菌的處理中，葉片細(xì)胞膜透性無(wú)顯著變化。值得注意的是，接種病菌后，施用發(fā)酵液顯著降低葉片細(xì)胞膜透性，分別比培養(yǎng)液降低了24.8%(接種后第7天)、14.0%(接種后第10天)、16.6%(接種后第13天)；若不接種病原菌，在培養(yǎng)液和發(fā)酵液之間，葉片細(xì)胞膜透性無(wú)顯著差異。

在番茄葉片中，丙二醛含量的變化類似細(xì)胞膜透性，即接種病原菌提高葉片丙二醛含量，且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，施用發(fā)酵液顯著降低接種病原菌葉片的丙二醛含量；相反，在不接種病原菌的處理中，葉片丙二醛含量無(wú)顯著變化，施用發(fā)酵液和培養(yǎng)液之間無(wú)顯著差異。

圖3 不同試驗(yàn)處理對(duì)番茄葉片細(xì)胞膜透性和丙二醛的影響

2.3.2 抗病相關(guān)酶活性

由表3可知，盆栽試驗(yàn)中，接種病菌顯著提高番茄葉片中的SOD、PPO、PAL活性，其平均值分別提高了12.9%、84.0%、36.0%。在接種病原菌的處理中，施用發(fā)酵液顯著提高了PPO和PAL活性，分別提高了35.8%和41.4%， 但對(duì)SOD無(wú)顯著影響。在不接種病原菌的處理中，施用發(fā)酵液對(duì)SOD、PPO、PAL活性無(wú)顯著影響。

表3 不同試驗(yàn)處理對(duì)番茄葉片SOD、PPO和PAL活性的影響

3 討論

一般而言，化學(xué)農(nóng)藥干擾動(dòng)物代謝，不同程度地危害人畜健康，有些化學(xué)農(nóng)藥還能產(chǎn)生致病、致癌、致變等作用，逐步由使用化學(xué)農(nóng)藥過(guò)度到安全無(wú)毒的生物防治是植物病蟲(chóng)害防治的目標(biāo)之一。目前，我國(guó)植物病蟲(chóng)害防治的主要手段仍然是化學(xué)藥劑。幾十年來(lái)，盡管做了大量的研究工作，但完全可以代替化學(xué)殺菌劑的生物農(nóng)藥還不多，研制高效、安全、無(wú)毒的新型生物農(nóng)藥很有必要。

研究發(fā)現(xiàn)，目前各國(guó)應(yīng)用較廣泛的生防菌木霉有很強(qiáng)的根際定殖能力，能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，提高葉綠素含量、促進(jìn)氮和礦物元素吸收，改善植物營(yíng)養(yǎng)；與根系微生物相互作用，抑制多種病原菌生長(zhǎng)；誘導(dǎo)辣椒、馬鈴薯、萵苣、黃瓜、白菜、豌豆、花生、長(zhǎng)春花和菊花等多種作物產(chǎn)生抗病性，具有防病促生效應(yīng)[12]。與之類似，生防菌寡雄腐霉卵孢子接種于黃瓜和胡椒根際，能改善它們的磷素營(yíng)養(yǎng)，增加植物體內(nèi)的吲哚乙酸(IAA)含量[9]，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。一般而言，有益微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)的現(xiàn)象常常與微生物產(chǎn)生生長(zhǎng)素和相關(guān)次級(jí)代謝物的合成具有密切聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)，寡雄腐霉產(chǎn)生大量色胺TNH2，當(dāng)寡雄腐霉在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的時(shí)候，還有一些植物生長(zhǎng)素前體，包括色氨酸Trp和吲哚乙酸IAAld，都表明寡雄腐霉產(chǎn)生色胺類生長(zhǎng)素復(fù)合物[21]。此外，寡雄腐霉還能分泌抗菌物質(zhì)[10]、擬激發(fā)子蛋白[21]、類毒素物質(zhì)色胺等[22]，它們細(xì)胞壁中的蟹殼素、葡聚糖、細(xì)胞壁蛋白等，都能保護(hù)和誘導(dǎo)多種蔬菜產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性[11]，如誘導(dǎo)小麥、甜菜、番茄對(duì)絲核菌R.solaniAG2- 2、番茄枯萎病(F.oxysporumf.sp.radicis-lycopersici)和灰葡萄孢(B.cinerea)的抗性反應(yīng)[23]。研究還發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)寡雄腐霉菌絲，勻漿后也能誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯菌的抗性[24]。據(jù)報(bào)道，施用寡雄腐霉卵孢子防病效果介于0—74.5%之間，促進(jìn)生長(zhǎng)的作用也不甚穩(wěn)定[11]，進(jìn)一步提高其防效很有必要。在本試驗(yàn)中，利用寡雄腐霉優(yōu)良菌株制備內(nèi)含次生代謝產(chǎn)物、具有生防作用的發(fā)酵液，噴施健康和感病的番茄植株。結(jié)果表明，健康植株施用寡雄腐霉發(fā)酵液后，葉綠素含量和根系活力提高，有益于增強(qiáng)光合作用，增加氮、磷、鉀養(yǎng)分吸收，促進(jìn)植株生長(zhǎng)；感病植株施用寡雄腐霉發(fā)酵液后，有效降低了番茄灰霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)。因此，寡雄腐霉發(fā)酵液不僅可以穩(wěn)定有效的防治番茄灰霉病，還能促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)，與生防菌木霉等有相同的生物學(xué)效應(yīng)。

植物受到病原菌侵染時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，多余的活性氧會(huì)影響植物的正常生理活動(dòng)，膜脂過(guò)氧化形成丙二醛等過(guò)氧化產(chǎn)物，從而不同程度地破壞細(xì)胞膜的完整性，膜透性增加、選擇透性降低、胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，環(huán)境介質(zhì)的電導(dǎo)率增加[25]。番茄植株接種灰霉病菌后，膜透性和丙二醛含量增加，但施用發(fā)酵液降低細(xì)胞膜透性和丙二醛含量，說(shuō)明寡雄腐霉發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物直接或間接地增強(qiáng)了植株抗性或減輕了灰霉病對(duì)番茄植株細(xì)胞膜等造成的傷害。

在病原菌、生防菌、植株三者相互作用過(guò)程中，生防菌可作為植物激活劑，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗病性(ISR)，與病原物誘導(dǎo)的植物系統(tǒng)獲得抗性(SAR)基本類似。ISR的作用機(jī)制主要是通過(guò)組織木質(zhì)化，增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械屏障和產(chǎn)生植保素，它們涉及到苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)與超氧化物歧化酶(SOD)等催化的生物化學(xué)過(guò)程，對(duì)于抵抗真菌、細(xì)菌和病毒，保護(hù)植物免受疫病危害，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，彌補(bǔ)損失，減輕病害程度有重要作用[26]。在病原菌誘導(dǎo)防御反應(yīng)研究中，有研究曾報(bào)道，番茄植株對(duì)細(xì)菌性潰瘍病Pseudomonassyringae的抵抗力與PPO活性呈顯著正相關(guān)，抗性強(qiáng)的品種PPO活性顯著高于敏感品種[27]。PAL和POD的活性與串珠鐮刀菌引起玉米對(duì)穗粒腐病抗性呈負(fù)相關(guān)，而與丙二醛含量的變化呈正相關(guān)[28]。在生防菌次生代謝產(chǎn)物提高植物抗病能力的研究中，李頌等也研究發(fā)現(xiàn)，施用黑曲霉次生代謝產(chǎn)物，可顯著提高番茄植株體內(nèi)SOD、PPO、PAL等防御性相關(guān)酶的活性[30]；在海洋芽孢桿菌B- 9987的無(wú)細(xì)胞濾液中，所含的活性物質(zhì)對(duì)茄鏈格孢菌和灰葡萄孢具有良好的生防作用[30]。在本試驗(yàn)中，番茄植株接種灰霉病菌后，SOD、PPO和PAL活性提高，施用寡雄腐霉發(fā)酵液進(jìn)一步提高了SOD、PPO和PAL活性，說(shuō)明灰霉病菌能誘導(dǎo)番茄植株產(chǎn)生抗性反應(yīng)，寡雄腐霉發(fā)酵液同樣也能提高保護(hù)酶和防御酶的活性，促進(jìn)合成抗性物質(zhì)，構(gòu)成保護(hù)性屏障，協(xié)同抗病，從而提高番茄植株的抗病能力，防止病原菌入侵，減輕病原菌產(chǎn)生的傷害作用。

總之，寡雄腐霉發(fā)酵液不僅能有效防治番茄灰霉病，而且還具有促進(jìn)番茄生長(zhǎng)的作用，顯著不同于只具有防病治病作用的生防制劑，進(jìn)一步開(kāi)展深入研究，可望制備出高效、穩(wěn)定、安全兼具防病促生的生物農(nóng)藥。

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