周寧寧, 王夢馨, 崔 林, 潘 鋮, 張新亭, 韓寶瑜

(中國計量學(xué)院浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室， 杭州 310018)

假眼小綠葉蟬Empoascavitis(G?the) 隸屬于半翅目(Hemiptera) 、葉蟬科(Cicadellidae)、小綠葉蟬屬(Empoasca)，廣泛分布于我國大陸茶區(qū)，繁殖快，世代重疊嚴(yán)重，抗藥性強，防治難度大，是我國茶樹上為害最重的害蟲。常年假眼小綠葉蟬可致長江中下游茶區(qū)夏、秋茶減產(chǎn)10%—15%，嚴(yán)重發(fā)生年份達50%以上[1]。研究者們對于假眼小綠葉蟬生物學(xué)習(xí)性、地理分布、危害損失估計和防治等進行了深入的研究[2- 3]，但關(guān)于其地理種群遺傳和分化情況的報道甚少，僅應(yīng)用 RAPD-PCR 技術(shù)鑒定了茶園小綠葉蟬類的優(yōu)勢種[4]。我國幅員遼闊，茶樹廣泛種植于秦嶺淮河以南的祖國南半壁，各茶區(qū)的自然地理條件差別大，茶樹種植制度不同，可以造就不同地理區(qū)域的種群或生態(tài)型；另一方面，假眼小綠葉蟬成蟲善爬善跳還具有一定的飛行能力，若蟲也善于爬行和跳躍，成、若蟲能適應(yīng)各種茶園生境。如果這種非遠(yuǎn)距離的擴散連續(xù)地或漸次地發(fā)生，則有可能使得不同地理區(qū)域的種群發(fā)生基因交流[5]。

隨著分子系統(tǒng)地理學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)越來越多地應(yīng)用到分子系統(tǒng)學(xué)研究中。mtDNA具有嚴(yán)格遵循母系遺傳，不發(fā)生重組、倒位、易位等突變現(xiàn)象以及進化速率快等特點，而常被用于分析昆蟲物種間及物種內(nèi)種群的分化程度[6- 7]。COI基因是線粒體蛋白編碼基因之一，密碼子第三位堿基可相對自由變異[8]。且COI的演化速率是其他線粒體蛋白編碼基因的3倍，兩端序列相對保守，是較好的分子標(biāo)記[9- 10]，已被用于研究玉米黃翅葉蟬Dalbulusmaidis、黃條脊冠葉蟬Aphrodesleafhoppers等葉蟬的遺傳多樣性[11- 12]。

目前主要以COI基因的部分序列進行遺傳多樣性研究。本實驗首次擴增得到我國13個主要茶葉種植省份的茶園假眼小綠葉蟬線粒體COI基因的全長序列，通過滑動窗口分析確定其突變位點的分布，并發(fā)現(xiàn)了茶園假眼小綠葉蟬線粒體COI基因存在不完整的終止密碼子。再利用此序列分析了茶園假眼小綠葉蟬種群間的遺傳多樣性、遺傳分化程度、基因流水平及分子變異情況等，以探討長期的地理阻隔對其種群遺傳特性的影響及其生態(tài)適生性、以及該葉蟬自身擴散和人工助遷等因素造成的種群變異，為針對不同地理區(qū)域假眼小綠葉蟬種群的控制策略提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

本實驗所用茶園假眼小綠葉蟬，在2011年10月—2013年10月期間采集于山東青島、河南西九華山、江蘇蘇州、安徽敬亭山、湖北英山、四川樂山、重慶永川、江西婺源、浙江蘭溪、湖南長沙、福建武夷山、廣西桂林、和云南勐海等13個產(chǎn)茶省的重點產(chǎn)茶縣市，詳情見表1。采集的成蟲和若蟲浸泡于無水乙醇中，放置于-20℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

取單頭假眼小綠葉蟬，放在加有適量液氮的1.5 mL離心管中，用無菌的研磨棒磨成粉末，采用動物組織快速提取試劑盒(VWI)，按照試劑盒說明書步驟進行基因組DNA提取。從提取的DNA樣品中取1 μL用Nanodrop 2000c 儀器(Thermo Scientific公司)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度，基因組DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CO I基因全長擴增和序列測定

根據(jù)葉蟬科線粒體COI基因兩端的保守區(qū)域，設(shè)計特異性引物用于擴增COI基因全長序列(擴增產(chǎn)物包括COI基因兩端的側(cè)翼序列，5′包括基因NADH 脫氫酶亞基2的部分序列，以及tRNATrp、tRNACys、tRNATyr3個相連的tRNA序列；3′端包括tRNALeu(UUR)序列以及COII基因部分序列)。引物序列：COI-F(正向引物)：5′- AACAACAGC TTTCTAGAAATTTGC- 3′,COI-R(反向引物)：5′-TTCCATAGTTGGTGAAGAAGC- 3′。擴增片段的長度約為1773 bp。

表1 假眼小綠葉蟬地理種群采集信息及供試個體數(shù)量

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

測序結(jié)果通過Chromas軟件讀取，用DNAMAN7.0對序列進行編輯，去除兩端的側(cè)翼序列。用Clustal X 1.8軟件進行多序列同源比對，并輔以人工校對，生成用于MEGA5.1軟件分析的數(shù)據(jù)格式[13]。將整理后的序列在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，確定目標(biāo)序列。使用MEGA5.1軟件分析堿基組成、變異位點及堿基轉(zhuǎn)換顛換比；基于Kimura- 2-Parameter模型計算種群間的遺傳距離；以琉璃葉蟬HomalodiscavitripennisCOI基因全長序列作為外群，采用NJ鄰接法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度(bootstrap)均進行1000次重復(fù)檢驗[14]。采用NETWORK4.6.1.2軟件繪制單倍型間的進化網(wǎng)絡(luò)圖[15]。利用DnaSP5.0軟件分析13個種群內(nèi)的單倍型多樣性Hd、核苷酸多樣性Pi、核苷酸平均差異數(shù)k，種群間核苷酸平均差異數(shù)Kxy、核苷酸歧義度Dxy、遺傳分化系數(shù)Gst與固定系數(shù)Fst等分子遺傳學(xué)系數(shù)，同時生成滑動窗口，分析突變位點在全長序列中的分布，并進行Tajima′sD中性檢驗[16- 17]。應(yīng)用Arlequin 3軟件進行AMOVA分子變異分析，判斷遺傳分化的主要來源是種群內(nèi)或種群間[18]。通過GenALEx 6.41軟件檢驗種群間的遺傳距離與地理距離的自然對數(shù)矩陣之間的相關(guān)性[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶園假眼小綠葉蟬線粒體CO I基因全長序列及滑動窗口分析

通過整理去除測序結(jié)果兩端側(cè)翼序列，得到茶園假眼小綠葉蟬線粒體COI基因全長序列，為1534 bp。該基因沒有完整的終止密碼子，最后一個堿基為T。從已報道的研究中可知，許多半翅目昆蟲，如琉璃葉蟬Homalodiscavitripennis(GenBank登錄號：NC_006899.1)、青蛾蠟蟬Geishadistinctissima(GenBank登錄號：NC_012617.1)[20- 21]以及紅頭鳳沫蟬Paphnutiusruficeps(GenBank登錄號：NC_021100.1)[22]，其線粒體COI基因以不完全終止密碼子(T)作為停止信號，與本研究所得結(jié)果一致。在13個種群176個個體中共發(fā)現(xiàn)突變位點113個，約占全長的7.37%，其中有7個位點的突變引起了氨基酸的改變(359，798，967，1175，1316，1330，1422)。單一多態(tài)位點40個，簡約信息位點73個，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失或插入現(xiàn)象。由表2可知，在所有核苷酸替換中，轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占87.61%，而顛換僅占12.39%。其中腺嘌呤(A)與鳥嘌呤(G)之間的轉(zhuǎn)換占總轉(zhuǎn)換數(shù)的30.8%，胞嘧啶(C)與胸腺嘧啶(T)之間的轉(zhuǎn)換占56.81%，值得注意的是，T轉(zhuǎn)換為C的比例高達43.68%?？傮w轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率R值為7.01。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，通常親緣關(guān)系較近的分類階元之間核苷酸替換主要為轉(zhuǎn)換，而在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的分類階元之間，核苷酸替換率則以顛換為主[23- 24]。本研究發(fā)現(xiàn)茶園假眼小綠葉蟬種內(nèi)線粒體COI基因核苷酸突變位點的變異類型以轉(zhuǎn)換為主，驗證了上述規(guī)律。

表2 假眼小綠葉蟬CO I基因堿基替換情況

通過軟件DnaSP5.0滑動窗口分析COI全長序列，結(jié)果見圖1。從圖中可以看到，序列間的突變位點在絕大部分區(qū)段內(nèi)均有分布。其中，在400 bp左右、700 bp到800 bp之間，1200 bp和1300 bp左右有較多的突變位點；前200 bp，900 bp左右，1100 bp左右的突變位點較少。由此可見，與使用基因的部分序列進行遺傳分化分析相比，使用序列的全長能夠包含更豐富的信息。

圖1 序列間突變位點的滑動窗口分析

2.2 茶園假眼小綠葉蟬CO I基因單倍型系統(tǒng)進化分析

從已獲得的176條COI基因全長序列中定義了105種單倍型：Hap1—Hap105。其中Hap5為共享單倍型，在所有種群中出現(xiàn)24次，占所有種群的13.64%。其余頻率較高的單倍型有：Hap16出現(xiàn)13次(7.39%)，Hap3和Hap26出現(xiàn)9次(5.11%)。在105種單倍型中，有84種單倍型是由單個種群所特有的獨享單倍型。由單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2，圖中僅顯示大于30%的置信度值bootstrap)可以看出，在幾個大分支中置信度較低，說明這些單倍型之間的差異較小，不能形成可靠的分支。而各種群的單倍型分散在不同的分布群中，未形成明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)。圖3是茶園假眼小綠葉蟬mtDNACOI基因105 種單倍型間的進化網(wǎng)絡(luò)圖，表現(xiàn)了各地理種群單倍型的分布情況，以及單倍型之間的演化關(guān)系。每種顏色代表一個種群的單倍型組成。沒有單倍型存在的那些節(jié)點是單倍型進化過程中的中間節(jié)點。單倍型Hap71在進化網(wǎng)絡(luò)的較為中心位置，而其他幾種出現(xiàn)頻率較高的單倍型則處于邊緣。由圖3中可以看到，各地理種群的單倍型散布于整個網(wǎng)絡(luò)圖中，每個種群由多種較為原始的單倍型演化產(chǎn)生的單倍型共同組成。說明種群間存在基因交流，分化程度較小。

2.3 茶園假眼小綠葉蟬不同地理種群的遺傳多樣性、種群間的基因流及遺傳分化分析

各種群COI基因單倍型、核苷酸多樣性分析及Tajima′sD中性檢驗結(jié)果如表2所示。由表可知，13個種群的總體單倍型多樣性指數(shù)Hd為0.9720，種群間核苷酸多樣性指數(shù)Pi為0.00607。種群內(nèi)核苷酸多樣性在0.00413—0.00651范圍內(nèi)，平均為0.00546。其中單倍型多樣性最高的種群是福建武夷山(FJWYS)，而云南勐海(YNMH)最低。核苷酸多樣性最高和最低的種群分別為湖南長沙(HNCS)和安徽敬亭山(AHJTS)。

圖2 利用鄰接法構(gòu)建的假眼小綠葉蟬不同地理種群CO I單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育樹

對各個地理種群的茶園假眼小綠葉蟬COI基因全長序列基于Tajima′sD值進行中性檢驗(表3)，檢測結(jié)果均不顯著，全部種群均為P>0.10，說明茶園假眼小綠葉蟬種群的進化過程遵循中性進化模型，各地理種群在進化過程中沒有出現(xiàn)群體擴張，群體大小保持相對穩(wěn)定。

表3 假眼小綠葉蟬CO I基因單倍型、核苷酸多樣性分析及Tajima′s D中性檢驗

圖3 105 種 mtDNA CO I基因 單倍型的進化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

應(yīng)用DnaSP5.0軟件計算反映茶園假眼小綠葉蟬種群間基因差異程度的遺傳學(xué)參數(shù)。各種群間核苷酸差異數(shù)Kxy在6.47778—13.37500之間，均值為8.98383；核苷酸歧義度Dxy在0.00422—0.00872之間，均值為0.00586(表4)。各地理種群總遺傳分化系數(shù)Gst為0.03652，總固定系數(shù)Fst為0.10876，總基因流Nm為4.097，固定系數(shù)Fst在-0.04168—0.43061之間。其中云南勐海(YNMH)種群與其他種群的遺傳分化程度最大(表5)。說明種群間分化程度低，基因交流頻繁。

通過AMOVA分子變異分析結(jié)果可以看出，不同地理種群之間的變異方差組分為0.59490(占方差比率的12.66%)，而種群內(nèi)的方差組分為4.10510(占方差比率的87.33%)且差異顯著(P<0.05)(表6)。說明這13個茶園假眼小綠葉蟬地理種群的遺傳分化主要來自于種群內(nèi)部，種群間的差異較小。

從表7可知，各個地理種群之間的遺傳距離在0.0042—0.0088之間。應(yīng)用Mantel相關(guān)性檢驗計算兩個矩陣之間的相關(guān)系數(shù)r為-0.0697(P=0.5373>0.05，1000次隨機抽樣)，表明這兩個矩陣之間沒有顯著的相關(guān)性，即不同種群之間的遺傳分化程度與地理隔離沒有顯著關(guān)系。

3 討論

同行專家們也發(fā)表了少量關(guān)于茶園葉蟬類種群分化和基因流的研究報道。在印度茶小綠葉蟬EmpoascaflavescensF. 是茶樹上的優(yōu)勢種，印度孟加拉邦的茶小綠葉蟬因茶園管理模式的不同引起了種群的遺傳分化[26]。在普通茶園中主要依靠噴施化學(xué)農(nóng)藥進行防治，而有機茶園主要依靠茶樹品種的抗蟲性與施用微生物農(nóng)藥防治，在這兩種管理模式下，茶小綠葉蟬面臨不同的選擇壓力，造成了不同管理模式的種群間差異大于相同管理模式下的種群間差異。在我國也有關(guān)于茶園假眼小綠葉蟬種群分化的初步研究，采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，探討了我國7個省份的茶園假眼小綠葉蟬的遺傳差異及其親緣關(guān)系[4]。

基于前人的相關(guān)成果，本研究采用線粒體COI基因全長序列，對我國主要產(chǎn)茶省份的茶園假眼小綠葉蟬不同地理種群的遺傳多樣性、遺傳分化程度、基因流水平及分子變異進行了解析，建立了單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和進化網(wǎng)絡(luò)圖。依據(jù)幾十年來的茶園葉蟬類發(fā)生和為害觀察、標(biāo)本收集及鑒定，茶園中約有10余種葉蟬，但優(yōu)勢種是假眼小綠葉蟬，其個體數(shù)占茶園葉蟬個體數(shù)的99.99%以上[27]，這個百分率很穩(wěn)定，不隨時間、地點的變化而改變，本研究的供試蟲態(tài)都是成蟲，供試標(biāo)本采集時間從2011年10月至2013年10月，采到的標(biāo)本立即浸入無水乙醇中，數(shù)小時之后就保存于-20℃?zhèn)溆?，可盡量消除采集時間因素對于試驗結(jié)果的影響。在13個種群176個個體中共發(fā)現(xiàn)突變位點113個，核苷酸替換以轉(zhuǎn)換為主。突變位點在整個區(qū)段內(nèi)均有分布，但不同位置的進化速率有所不同。共產(chǎn)生105種單倍型，具有較高的單倍型多態(tài)性。其中單倍型Hap5為共享單倍型，這種單倍型可認(rèn)為是能夠適應(yīng)環(huán)境變化并在種群中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢單倍型，該單倍型很有可能就是祖先單倍型[28- 29]；在所有的單倍型中，有84種是獨享單倍型，是由單個種群所特有的。各地理種群內(nèi)具有較為豐富的單倍型多樣性，表明茶園假眼小綠葉蟬對于不同環(huán)境具有較強的生存能力，這與假眼小綠葉蟬廣泛存在于各種茶園環(huán)境中的情況一致。從單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹來看，單倍型的分布與其所在的地理單元之間不存在明顯的對應(yīng)關(guān)系。Tajima′sD檢驗是基于種內(nèi)多態(tài)性的一種中性檢驗方法，可反映出物種種群變化動態(tài)的歷史。統(tǒng)計值為正值時說明序列進化方式為平衡選擇，且有一些單倍型分化；負(fù)值時為負(fù)向選擇，種群的擴張存在瓶頸效應(yīng)。本實驗中總?cè)后w和各個地理種群的檢測結(jié)果均不顯著，說明茶園假眼小綠葉蟬種群的進化過程遵循中性進化模型，過去沒有出現(xiàn)群體擴張和持續(xù)性增長，群體大小保持相對穩(wěn)定[17]。固定系數(shù)Fst是一種種群間遺傳距離的測度參數(shù)[30]，從本實驗的Fst值上看不同地理種群之間存在一定程度的遺傳分化?；蛄骷慈后w間基因交流，是種群遺傳結(jié)構(gòu)均質(zhì)化的主要因素之一，具有高水平基因流的種群間往往比具有有限基因流的種群間的遺傳分化程度小[31]。本實驗中總基因流Nm為4.097>4，當(dāng)Nm>4時，種群間的基因交流比較充分，均質(zhì)化作用足以抵制遺傳漂變的作用，一定程度上抵消種群間的遺傳分化[32]。通過AMOVA分子變異分析可以看出，假眼小綠葉蟬的遺傳分化主要來自于種群內(nèi)部，種群間的差異較小。通過Mnatel檢驗可知，不同種群之間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著關(guān)系。

表4 假眼小綠葉蟬成對種群間的核苷酸平均差異數(shù) (Kxy) (上三角) 與核苷酸歧義度(Dxy)(下三角)

表5 假眼小綠葉蟬成對種群間的遺傳分化系數(shù) (Gst) (上三角) 與固定系數(shù)(Fst)(下三角)

表6 假眼小綠葉蟬13個地理種群CO I基因全長序列的分子變異分析

表7 假眼小綠葉蟬13個地理種群的地理距離自然對數(shù)值(km) (上三角)與遺傳距離(下三角)

綜上所述，認(rèn)為假眼小綠葉蟬種群的進化過程遵循中性進化模型，群體大小保持相對穩(wěn)定，這與茶園中假眼小綠葉蟬每年保持高發(fā)生量的情況相吻合，因為許多茶區(qū)每年假眼小綠葉蟬發(fā)生時間、發(fā)生量和施藥次數(shù)基本不變，每年都是10多次。假眼小綠葉蟬種群間存在一定程度的遺傳分化，這是因為我國幅員廣大，不同茶園所在的自然地理條件存在較大差異，不同地理種群之間的假眼小綠葉蟬可能存在著生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特征的差異而有一定遺傳分化。而較為充分的基因交流帶來的均質(zhì)化作用，在一定程度上抵消了種群間的遺傳分化。種群間假眼小綠葉蟬充分的基因交流主要源于假眼小綠葉蟬自然遷移和人為傳播兩方面的原因。假眼小綠葉蟬成蟲本身具有一定的飛行擴散能力，能適應(yīng)各種地理環(huán)境，這種近距離的擴散行為一直在進行中，能夠引起不同種群間一定程度的基因交流。相比于茶園假眼小綠葉蟬的自然遷移，人為助遷的作用十分突出。在許多茶人們的印象中，20世紀(jì)50年代省際茶區(qū)之間假眼小綠葉蟬的體色等特征是有差異的，可能意味著大尺度的自然地理景觀條件下該葉蟬種群存在生態(tài)型的差異。然而，20世紀(jì)90年代以后，省內(nèi)茶區(qū)之間、省際之間茶樹鮮葉的異地加工十分活躍，幫助了茶園假眼小綠葉蟬的大規(guī)模遷移，比如，近些年來從早春至深秋，黔、川、渝、皖南、豫南茶區(qū)鮮葉源源不斷地調(diào)往浙、蘇茶區(qū)加工以獲得高價出售，這些鮮葉夾帶了大量的假眼小綠葉蟬成蟲、若蟲和卵，它們隨著茶樹鮮葉在1—3日內(nèi)遷移幾百—幾千km；閩南、閩北茶區(qū)茶苗不斷調(diào)往浙、蘇南、皖南、魯南和豫南等茶區(qū)，浙西茶區(qū)的安吉白茶茶苗持續(xù)調(diào)往周邊各省茶區(qū)。到達新區(qū)的假眼小綠葉蟬很快適應(yīng)了當(dāng)?shù)夭鑸@環(huán)境，經(jīng)過幾百代的世代更替，使得假眼小綠葉蟬不同地理種群生態(tài)型的差異逐漸消失。這也解釋了為何假眼小綠葉蟬的遺傳分化主要來自于種群內(nèi)部、種群間的差異較小、以及種群之間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著關(guān)系。

需要一提的是：來自西南邊陲的云南勐海種群(YNMH)在所有種群中單倍型多樣性Hd最小，與其他種群的遺傳分化程度最大，與其他種群之間的遺傳距離也最大，而除云南以外其他種群之間的差異比較一致。這說明了云南的茶園假眼小綠葉蟬相比較于其他種群來說處于一個相對封閉的環(huán)境中，與其他種群基因交流較小。這是因為云南的茶樹多為喬木型、半喬木型，茶園地理環(huán)境、氣候和植被、以及茶葉內(nèi)含物等顯著區(qū)別于其他假眼小綠葉蟬種群所在茶區(qū)的相應(yīng)因素。而且采集YNMH種群的云南的茶園處于原始森林，交通不便、人跡罕至，該假眼小綠葉蟬種群較為獨立，與其他種群的交流較少。

本研究首次擴增得到茶園假眼小綠葉蟬COI基因的全長序列，并將其應(yīng)用到種群間的遺傳分化研究中。與使用COI基因的部分序列進行遺傳分化分析相比，使用序列的全長包含了更豐富的信息，獲得了充分的變異位點及較為全面的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。在下一步的研究中，還需要配合其他分子標(biāo)記，比如線粒體的控制區(qū)以及核基因上的分子標(biāo)記，增加試驗采樣點及樣本數(shù)量，進一步加深對中國茶園假眼小綠葉蟬種群間關(guān)系及遺傳機制的研究。

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