易美芝，延根，張桂珊，耿寬，吳仁華

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤。雖然先進(jìn)的外科技術(shù)得以進(jìn)一步發(fā)展，新穎的局部放射治療和化療不斷涌現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率仍居高不下，最主要的原因還是膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)模式[1]。惡性侵襲性腦膠質(zhì)瘤具有從瘤體中心向瘤周腦組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)數(shù)厘米特性[2]。膠質(zhì)瘤侵襲邊界的識(shí)別能為臨床對(duì)腦膠質(zhì)瘤的評(píng)估和治療提供重要的參考信息，而常規(guī)MR結(jié)構(gòu)成像序列對(duì)肉眼無(wú)法識(shí)別瘤體以外的腫瘤細(xì)胞探測(cè)并不敏感。

MR波譜(MRS)是一項(xiàng)非侵襲性的檢測(cè)腦代謝物變化手段，它能準(zhǔn)確定量腦內(nèi)主要代謝物濃度。據(jù)研究報(bào)道，不同腦代謝物的絕對(duì)濃度或代謝物之間比率能預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤的級(jí)別、侵襲范圍[3]及預(yù)后[4]情況。目前對(duì)腦膠質(zhì)瘤代謝物MRS研究時(shí)感興趣區(qū)主要是放在瘤體實(shí)質(zhì)部分，但是實(shí)質(zhì)部分以外其他部位，尤其是腫瘤周邊組織代謝情況卻很少給予分析，且對(duì)代謝物定量方面也僅僅局限于利用各代謝物間濃度比率。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃?.0 T這一超高磁場(chǎng)下，利用MRS技術(shù)及LCModel后處理軟件獲得腦膠質(zhì)瘤不同部位代謝物絕對(duì)濃度、分析其代謝特征。希望實(shí)驗(yàn)方法能為評(píng)斷腦膠質(zhì)瘤潛在邊界提供有效的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性SD大鼠20只，購(gòu)于汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重250～300 g，隨機(jī)等量分成2組，置于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。C6膠質(zhì)瘤細(xì) 胞購(gòu)于上海中科院 細(xì)胞庫(kù)，在含有10%胎牛血清 的DMEM/F12的培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。Agilent 7.0 T (USA)動(dòng)物專用MR掃描儀，以及與其匹配的直徑160 mm表面線圈。立體定向儀購(gòu)于中國(guó)RWD Life Science公司， Gd-DTPA購(gòu)于中國(guó)北陸公司。

1.2 方法

(1)動(dòng)物模型的制備：當(dāng)C6細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將腫瘤細(xì)胞制成懸液，濃度為106/10 μl。用10%的水合氯醛(3.3 ml/kg)腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)鼠后，在立體定向儀引導(dǎo)下，選定鼠腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)為進(jìn)針靶點(diǎn)，具體坐標(biāo)是：前囟前1 mm，矢狀縫右3 mm，硬膜下6 mm，接種量為10 μl。細(xì)胞懸液注射速度要不超過(guò)1 μl/min，注射完畢后停針5 min，最后緩慢拔針，骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚，切口消毒，重置于 SPF環(huán)境培養(yǎng)。(2)動(dòng)物模型MR掃描：荷瘤大鼠及正常組大鼠于術(shù)后7 d行MRI和MRS檢查，同樣用10%的水合氯醛(3.3 ml/kg)腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)室，取俯臥位固定于上，先后完成MRI常規(guī)平掃、1H MRS和MRI增強(qiáng)掃描，掃描均選用冠狀位。MRI及MRS參數(shù)設(shè)定：T1WI選擇SEMS序列，TR 350 ms，TE 最小，F(xiàn)OV 25 mm×25 mm，Average 8，Matrix 192×192。T2WI掃描選擇FSEMS序列，TR 2500 ms，ESP 12 ms，Average 8，Matrix 192×192。MRS采集于T1、T2掃描以后，采用STEAM序列，TR 5000 ms，TE 60 ms，在3個(gè)層面T2WI上定位，Average 320次，F(xiàn)OV 3 mm×3 mm×3 mm，ROI分別放在腫瘤中心、腫瘤實(shí)體部分、腫瘤周邊和對(duì)側(cè)正常腦組織。定位，勻場(chǎng)及壓水后得到原始波譜圖像。再將原始波譜數(shù)據(jù)通過(guò)LCModel軟件量化分析處理可以得到代謝物的絕對(duì)濃度。最后行Gd劑增強(qiáng)MRI，參數(shù)如上T1掃描。增強(qiáng)掃描是經(jīng)尾靜脈注入Gd-DTPA (1.2 ml/kg)后立即進(jìn)行。(3)組織病理學(xué)檢查：所有上述掃描序列完成后，將實(shí)驗(yàn)鼠處死，把實(shí)驗(yàn)鼠腦組織經(jīng)石蠟包埋后切4 um薄片，HE染色。(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：最終波譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件。采用One-Way Anova檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：雙側(cè) ɑ=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型臨床表現(xiàn)

種植腫瘤細(xì)胞7 d后SD大鼠活動(dòng)量減少，飲水及攝食降低，毛發(fā)失去光澤，眼周淤血，逐漸出現(xiàn)偏癱、昏迷直至死亡。

2.2 MRI表現(xiàn)

所有荷瘤鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)見(jiàn)異常信號(hào)影，呈橢圓形膨脹性生長(zhǎng)。T1WI上等、低信號(hào)，T2WI上等、高信號(hào)，邊界欠清晰。瘤灶周邊的腦組織與瘤體分界欠清，瘤灶周邊腦組織與對(duì)側(cè)正常腦組織在任何一層MRI上從肉眼上觀察信號(hào)幾乎無(wú)差異。Gd增強(qiáng)動(dòng)態(tài)掃描病灶呈明顯延遲強(qiáng)化(圖1)。

2.3 MRS結(jié)果

行MRS掃描時(shí)，波譜數(shù)據(jù)通過(guò)LCModel和SPSS軟件分析、統(tǒng)計(jì)，最終得到了一系列有規(guī)律性的結(jié)果。

(1)從腫瘤中心、腫瘤實(shí)體部分、腫瘤周邊組織到對(duì)側(cè)正常腦組織，NAA和tCr濃度呈逐漸上升趨勢(shì)：腫瘤周邊組織與對(duì)側(cè)正常腦組織間NAA濃度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.996)，其他各組間NAA濃度兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0)；腫瘤周邊組織與對(duì)側(cè)正常腦組織間 tCr濃度比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.053)，其他各組間tCr濃度兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(其中腫瘤實(shí)體部分與腫瘤周邊組織間P=0.012，其余各組間P值均=0)。(2)從腫瘤中心到對(duì)側(cè)正常腦組織，Ala濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，僅腫瘤實(shí)體部分與對(duì)側(cè)正常腦組織間Ala濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P=0.016)，其他各組間Ala濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。(3)Tau和Ins濃度在腫瘤周邊組織達(dá)到最低：腫瘤中心、腫瘤實(shí)體部分和對(duì)側(cè)正常腦組織與腫瘤周邊組織間Tau濃度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.019、0.016、0.009)；腫瘤中心、腫瘤實(shí)體部 分和對(duì)側(cè)正常腦組織與腫瘤周邊組織間Ins濃度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.036、0、0.018)。Glx濃度在腫瘤周邊達(dá)到最高：腫瘤中心與對(duì)側(cè)正常腦組織、腫瘤中心與腫瘤周邊組織、腫瘤實(shí)體部分與腫瘤周邊組織間Glx濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P=0)，腫瘤實(shí)體部分、腫瘤周邊組織與對(duì)側(cè)正常腦組織間Glx濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P值分別為0.003、0.012)，腫瘤實(shí)體部分與腫瘤中心組織間Glx濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P=0.002)。Cho、Lip、Lac濃度在各組間并無(wú)明顯規(guī)律可循(圖2)。

2.4 病理學(xué)結(jié)果

HE染色低倍鏡下觀察見(jiàn)腫瘤無(wú)包膜，腫瘤細(xì)胞呈巢狀排列，瘤內(nèi)常見(jiàn)出血及壞死灶，高倍鏡下觀察， 瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，核大、多核、核質(zhì)深染、異形性高(圖3)。

3 討論

3.1 檢測(cè)膠質(zhì)瘤侵襲性的新技術(shù)

雖然病理學(xué)檢查是診斷和評(píng)估腦膠質(zhì)瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床工作中，神經(jīng)影像學(xué)仍然是檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的重要手段，尤其當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)在腦功能區(qū)域時(shí)。許多前期研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤瘤體周邊那些看似正常的腦組織內(nèi)其實(shí)包含了自由水，具有侵襲的腫瘤細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞及反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞[5]。常規(guī)MRI成像序列因其有較高的分辨率及信噪比能清晰顯示膠質(zhì)瘤的形態(tài)、提供豐富的解剖學(xué)信息，但在顯示瘤體潛在浸潤(rùn)邊界上尚有一定局限性。MRS同樣是以MRI基本原理為基礎(chǔ)，從分子學(xué)角度監(jiān)測(cè)腦組織的代謝情況，能反映出瘤周腦組織受腫瘤細(xì)胞侵襲情況，繼而可以判斷腫瘤的分級(jí)、增殖及預(yù)后。

3.2 腦膠質(zhì)瘤灶不同部位代謝物MRS特征及分析

圖2 載瘤模型4個(gè)不同部位氫質(zhì)子MRS圖。A：腫瘤中心部分；B：腫瘤實(shí)體部分；C：腫瘤周邊部分；D：對(duì)側(cè)正常腦組織Fig.2 Representative proton MR spectroscopy spectra from 7.0 T in four different areas.A: Localized proton spectrum of the tumour center.B: Localized proton spectrum of the tumour solid part.C: Localized proton spectrum of the peritumoral normal-appearing tissue.D: Localized proton spectrum of the contralateral white matter.

NAA的化學(xué)位移是在2.0 ppm處，它被視為是神經(jīng)元的標(biāo)志，許多疾病如：腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、多發(fā)硬化及惡性腦腫瘤都會(huì)引起一定程度NAA下降[6]，其含量可以單獨(dú)或聯(lián)合Cho來(lái)鑒別腫瘤及非腫瘤組織[7]。NAA的濃度也與腫瘤級(jí)別和患者年齡呈反比。本實(shí)驗(yàn)病理切片顯示腫瘤中心區(qū)域有明顯壞死及出血灶，故其內(nèi)NAA含量比腫瘤實(shí)體部分要低，在常規(guī)MRI下肉眼無(wú)法識(shí)別腫瘤周邊組織信號(hào)的改變，而腫瘤周邊組織內(nèi)NAA濃度卻低于對(duì)側(cè)正常腦組織，雖然濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍在一定程度上提示腫瘤周邊組織結(jié)構(gòu)可能存在的破壞。從對(duì)側(cè)正常腦組織到腫瘤中心部分，NAA濃度的梯度變化，可以反映正常神經(jīng)元被腫 瘤細(xì)胞取代這一過(guò)程。tCr峰在3.02 ppm處可以探測(cè)到，tCr由Cr和Pcr共同組成的，被認(rèn)為是能量代謝標(biāo)記物，目前其含量一直被大多數(shù)人認(rèn)為是比較穩(wěn)定的[8]，但仍有部分研究者還是發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤，尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤中，其濃度會(huì)有相應(yīng)程度的減低，并被認(rèn)為導(dǎo)致其濃度減低原因是腫瘤代謝率增高了，但是其具體的特異性生化機(jī)制目前暫未知。從對(duì)側(cè)正常腦組織到腫瘤中心tCr濃度逐漸減低的趨勢(shì)提示相應(yīng)部位組織代謝率可能在逐步增加。

Ala共振峰在1.47 ppm處，它的變化與Lac相似，依據(jù)TE的長(zhǎng)短顯示為正立或倒置的雙峰，有時(shí)與Lac峰很難鑒別，與其他腦腫瘤相比較，Ala在腦膜瘤中的出現(xiàn)頻率會(huì)稍高一點(diǎn)[9]。從腫瘤中心到對(duì)側(cè)正常腦組織，Ala濃度呈逐漸減低趨勢(shì)，這個(gè)結(jié)果與Ziegler等[10]的研究結(jié)果相符合。Lac和Ala是能量代謝的中間產(chǎn)物，故這兩種物質(zhì)與腫瘤代謝密切相關(guān)。同Lac一樣，腫瘤內(nèi)增高的糖酵解可以解釋增高的Ala濃度。

圖3 荷瘤模型病理學(xué)結(jié)果。A：肉眼所見(jiàn)病理切片橫斷面，病灶中心可見(jiàn)明顯出血及壞死；B：HE染色，可見(jiàn)多個(gè)大的深染的核異性細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞聚集呈巢樣生長(zhǎng)Fig.3 Pathology photos of a rat C6 glioma model.A: Globular brain-tumor can obviously be seen in naked eye with a central hemorrhage and necrosis.B: HE staining confi rms tumors specimen in all tested tissues.The tumor cells are spindle-shaped into density, with large and deep stained nuclear, which arranges into whirlpool nest in the tumor.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tau和Ins濃度在腫瘤周邊組織達(dá)到最低，Glx濃度在腫瘤周邊組織達(dá)到最高，且這三種物質(zhì)的濃度在腫瘤周邊與其他各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，筆者認(rèn)為這三種物質(zhì)濃度的改變?cè)谂袆e腫瘤的潛在邊界具有相對(duì)特異性。Tau是一種氨基磺酸，在3.3 ppm處能夠被探測(cè)到其共振峰，發(fā)育中的小腦和小腦皮質(zhì)層中這種物質(zhì)的含量很豐富。Hekmatyar等[11]研究發(fā)現(xiàn)模擬人類腦成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的荷瘤鼠瘤灶內(nèi)Tau 濃度顯著高于對(duì)照組正常鼠，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tau與腫瘤的侵襲性行為密切相關(guān)。Opstad等[12]研究發(fā)現(xiàn)患有成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的幼兒腦病灶內(nèi)Tau濃度明顯升高，并證實(shí)Tau是一種可以鑒別不同種類腦腫瘤的特殊代謝物。這些發(fā)現(xiàn)奠定了Tau和其他某些代謝物一樣可被納入腫瘤侵襲性及分類標(biāo)志的基礎(chǔ)。Ins是在氫質(zhì)子波譜內(nèi)可探測(cè)到的含量最豐富的代謝物之一。它是一種與細(xì)胞膜的更新和細(xì)胞磷脂層結(jié)構(gòu)有關(guān)的物質(zhì)[13]，因此任何一種形式的細(xì)胞膜更新的加快或細(xì)胞膜磷脂層的破壞都可以導(dǎo)致Ins濃度的升高。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有高濃度的Ins[14]，并且還證實(shí)了它是同膠質(zhì)細(xì)胞的激活相關(guān)聯(lián)。在腦膠質(zhì)瘤內(nèi)升高的Ins可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞密度的增加，同時(shí)在一定程度上提示腫瘤細(xì)胞膜的更新和細(xì)胞增殖的加快，故也是一種潛在的MRS診斷標(biāo)記物。近些年來(lái)，研究者對(duì)Glx的研究逐年增多，它起源于2.35 ppm和3.76 ppm處的譜峰，是由Glutamate和Glutamine組成。Glx濃度的變化被認(rèn)為是一種反映腫瘤代謝旁 路變化的指標(biāo)。至于為什么Tau、Ins、Glx在瘤周腦組織濃度有如此特殊的分布還有待于后期實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。 Cho、Lip、Lac濃度在本實(shí)驗(yàn)各組間無(wú)明顯規(guī)律可循，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法對(duì)其作出有價(jià)值的分析。

3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)與不足

本實(shí)驗(yàn)最大優(yōu)勢(shì)在于利用7.0 T超高場(chǎng)動(dòng)物專用MR掃描儀采集相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，它比臨床上常用的MR掃描儀器場(chǎng)強(qiáng)更高、勻場(chǎng)更均勻，配有兩路射頻通道、四路接收通道、多種體線圈和表面線圈。該掃描儀具有高達(dá)100 μm的空間分辨率和300 mT/rn的梯度磁場(chǎng)強(qiáng)度，組織分辨率高，高場(chǎng)強(qiáng)MR成像系統(tǒng)則提高了空間分辨率且縮短了成像時(shí)間，對(duì)研究組織器官微觀結(jié)構(gòu)，以及其生化代謝過(guò)程等有十分重要的作用[15]。實(shí)驗(yàn)不足之處是MRS數(shù)據(jù)采集時(shí)用到的STEAM序列，STEAM序列是最常用的單體素波譜采集序列，其與多體素波譜序列明顯不同之處是采集目標(biāo)組織的空間涵蓋量，多體素波譜序列能在同一時(shí)間內(nèi)多部位采集波譜數(shù)據(jù)，后期實(shí)驗(yàn)若能使用多體素波譜序列將能進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性及效率。

綜上所述，本研究證實(shí)，在7.0 T高場(chǎng)MRI下，能夠獲得實(shí)驗(yàn)小鼠腦膠質(zhì)瘤的小ROI的有效的1H波譜。1H MRS技術(shù)是一種獲取腦膠質(zhì)瘤不同部位代謝特征、判斷其潛在受侵范圍的重 要手段。同時(shí)，Tau、Ins和Glx可能對(duì)判斷腦膠質(zhì)瘤潛在瘤體邊界提供重要的參考信息。

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