丁 兆 偉，祖 國(guó) 仁，許 濤，韓 鵬 軍，浦 軍 平，

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.張家港市華昌藥業(yè)有限公司，江蘇 張家港 215600)

0 引 言

D－丙氨酸是一種非天然氨基酸，一種重要的有機(jī)手性源，主要應(yīng)用于手性藥物、手性添加劑、手性助劑等領(lǐng)域，在制藥及食品行業(yè)作為手性合成的手性源[1－2]。目前D－丙氨酸主要用于生產(chǎn)新型廣譜抗生素、D－丙氨醇、多肽合成過(guò)程的丙氨酸保護(hù)劑、食品添加劑以及化妝品[3－4]。同時(shí)，D－丙氨酸也廣泛應(yīng)用在功能性食用甜味劑方面。D－丙氨酸是合成二肽甜味劑阿力甜的一種重要的原料[5]。D－丙氨酸的制備方法主要有微生物發(fā)酵法[6]、化學(xué)合成法[7]和酶拆分法[8－12]。本實(shí)驗(yàn)采用的是國(guó)際上先進(jìn)的微生物降解法[13]，對(duì)從發(fā)酵液中提取D－丙氨酸的工藝進(jìn)行了初步的研究。通過(guò)研究提取的工藝路線，從發(fā)酵液除菌、發(fā)酵液脫色等工藝條件的優(yōu)化，生產(chǎn)得到高純度的D－丙氨酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵液，取自張家港華昌藥業(yè)有限公司中試車(chē)間；菌種，公司內(nèi)部菌種編號(hào) HP－003；D－丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，sigma公司產(chǎn)品，用于色譜分析標(biāo)準(zhǔn)品；氫氧化鈣、草酸銨、甲醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BJF－8TCM 1.0－Y陶瓷膜過(guò)濾器，江蘇久吾高科股份有限公司；R202旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申圣生物技術(shù)有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國(guó)DIONEX公司；

1.3 分析方法

發(fā)酵液菌密度(OD值)的測(cè)定：分光光度計(jì)721(純水作參照，10mm光程，波長(zhǎng)660nm)。脫色液透光率的測(cè)定：分光光度法(純水作參照，10mm光程，波長(zhǎng)430nm)。發(fā)酵液中D－丙氨酸含量的測(cè)定：高效液相色譜法[14]。產(chǎn)品的檢驗(yàn)：按日本味之素企業(yè)(AJI97)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝路線

利用微生物降解法以DL－丙氨酸為底物生產(chǎn)D－丙氨酸時(shí)，發(fā)酵液pH會(huì)上升，遂采用低濃度硫酸進(jìn)行調(diào)酸，同時(shí)設(shè)計(jì)了D－丙氨酸提取工藝的路線見(jiàn)圖1。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)陶瓷膜過(guò)濾器，能夠去除菌體、大分子蛋白和固形物，接著利用鈣鹽沉淀法，先加入過(guò)量的Ca(OH)2去除，過(guò)濾后再添加過(guò)量的草酸銨去除多余的Ca2＋，然后利用減壓驅(qū)氨、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、離心分離、烘干等步驟分離得到D－丙氨酸成品。

圖1 D－丙氨酸提取工藝路線Fig.1 D－alanine recovery process line

2.2 陶瓷膜過(guò)濾試驗(yàn)

1m3的發(fā)酵液通過(guò)8m2截留分子質(zhì)量為10萬(wàn)u、平均通量800L／m2·h的陶瓷膜過(guò)濾設(shè)備，控制操作壓力0.1～0.5MPa，最后添加0.1m3的純水透析。檢測(cè)陶瓷膜過(guò)濾前后料液性質(zhì)的變化。

2.3 鈣鹽沉淀試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)陶瓷膜過(guò)濾的料液，先添加過(guò)量的Ca(OH)2以去除，再添加稍過(guò)量的草酸銨除去Ca2＋，過(guò)濾去除沉淀收集過(guò)濾液。

2.4 活性炭脫色試驗(yàn)

2.4.1 單因素試驗(yàn)

選取對(duì)脫色效果影響顯著的4個(gè)因素，即活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間、脫色時(shí)的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.4.2 正交試驗(yàn)

以所作單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)表，并根據(jù)正交試驗(yàn)表的條件進(jìn)行試驗(yàn)，從而確定活性炭脫色的最佳條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 陶瓷膜過(guò)濾前后發(fā)酵液性質(zhì)的變化

用截留分子質(zhì)量為10萬(wàn)u的陶瓷膜過(guò)濾器可以有效地去除菌體，陶瓷膜過(guò)濾前后料液的變化見(jiàn)表1，發(fā)酵液中的菌體幾乎完全除去，過(guò)濾液澄清，計(jì)算D－丙氨酸的平均回收率為98.55%。

表1 陶瓷膜過(guò)濾前后發(fā)酵液性質(zhì)的變化Tab.1 The change of fermentation broth properties before and after the ceramic membrane filtration

3.2 鈣鹽沉淀法除雜工藝

對(duì)于陶瓷膜過(guò)濾的料液，先根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中添加硫酸的量確定Ca(OH)2的添加量，添加過(guò)量的Ca(OH)2反應(yīng)30min，等反應(yīng)完全后過(guò)濾除去沉淀，從而去除，收集過(guò)濾液。再根據(jù)溶液中Ca2＋的濃度，將草酸銨配成5%的質(zhì)量濃度，添加適量的草酸銨直到溶液無(wú)沉淀為止，從而去除溶液中的Ca2＋，過(guò)濾去除沉淀收集過(guò)濾液。

3.3 活性炭脫色條件的確定

經(jīng)過(guò)鈣鹽沉淀，料液呈黃色，需要通過(guò)活性炭脫色達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，活性炭的添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間和脫色時(shí)的攪拌速度對(duì)于脫色效果的影響較大。分別對(duì)活性炭的添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間和脫色時(shí)的攪拌速度，并以脫色液的透光率作為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，從而確定最佳的脫色條件。

3.3.1 活性炭的添加量對(duì)于脫色效果的影響

活性炭的添加量按0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%加入到1L減壓驅(qū)氨的料液中，脫色溫度80℃、脫色時(shí)間60min、攪拌轉(zhuǎn)速150r／min進(jìn)行脫色，脫色結(jié)束后過(guò)濾，測(cè)清液的透光率。得出活性炭的添加量對(duì)脫色效果的影響如圖2所示。由圖2可以看出隨著活性炭的添加量的增加，脫色液的透光率也逐漸增加，當(dāng)活性炭的添加量為0.75%時(shí)脫色液的透光率已達(dá)92.1%。當(dāng)活性炭的添加量再增加時(shí)，脫色液的透光率增加已經(jīng)不再明顯。因此，活性炭的最適添加量為0.75%。

圖2 活性炭的添加量對(duì)脫色效果的影響Fig.2 Effect of activated carbon dosage on decolorization

3.3.2 溫度對(duì)脫色效果的影響

活性炭的添加量為0.5%加入到1L減壓驅(qū)氨的料液中，分別采用不同的脫色溫度60、70、80、90、100 ℃，脫 色 時(shí) 間 60min、攪 拌 轉(zhuǎn) 速150r／min進(jìn)行脫色，脫色結(jié)束后過(guò)濾，測(cè)清液的透光率。得出脫色溫度對(duì)脫色效果的影響如圖3所示。由圖3可以看出隨著溫度的逐漸提高，脫色液的透光率也增加。當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)脫色液的透光率已達(dá)91.5%，由于溫度太高可能會(huì)使氨基酸發(fā)生變化，所以最適的脫色溫度為90℃。

3.3.3 時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

活性炭的添加量為0.5%加入到1L減壓驅(qū)氨的料液中，分別采用不同的脫色時(shí)間20、40、60、80、100min，脫色溫度80℃、攪拌轉(zhuǎn)速150r／min進(jìn)行脫色，脫色結(jié)束后過(guò)濾，測(cè)清液的透光率。得出脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響如圖4所示。由圖4可以看出隨著脫色時(shí)間增加，脫色液的透光率也增加。當(dāng)脫色溫度達(dá)到60min時(shí)脫色液的透光率最高，達(dá)到89.8%。所以最適的脫色時(shí)間為60min。

圖3 溫度對(duì)脫色效果的影響Fig.3 Effect of temperature on decolorization

圖4 時(shí)間對(duì)脫色效果的影響Fig.4 Effect of time on decolorization

3.3.4 攪拌速度對(duì)脫色效果的影響

活性炭的添加量為0.5%加入到1L減壓驅(qū)氨的料液中，分別以不同的攪拌轉(zhuǎn)速50、100、150、200、250r／min，脫色溫度80 ℃、脫色時(shí)間60min進(jìn)行脫色，脫色結(jié)束后過(guò)濾，測(cè)清液的透光率。得出攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)脫色效果的影響如圖5所示。由圖5可以看出，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，脫色液的透光率也增加。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到200r／min時(shí)透光率已達(dá)91.2%。所以最適的攪拌轉(zhuǎn)速為200r／min。

圖5 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)脫色效果的影響Fig.5 Effect of stirring speed on decolorization

3.3.5 脫色條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇活性炭的添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時(shí)間(C)、攪拌轉(zhuǎn)速(D)四因素，各取三水平，按正交設(shè)計(jì)表L9(34)安排試驗(yàn)，確定活性炭脫色的最佳條件。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Result of L9(34)orthogonal test

由表3極差分析得，極差B＞C＞D＞A，影響脫色效果的主要因素是B，其次是C，A和D的影響最小。由極差分析可得最佳脫色條件為A2B3C3D2，即活性炭的添加量為0.75%，脫色溫度95℃，脫色時(shí)間70min，攪拌轉(zhuǎn)速200r／min。

3.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計(jì)表的試驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。按最佳脫色條件活性炭的添加量0.75%、脫色溫度95℃、脫色時(shí)間70min、攪拌轉(zhuǎn)速200r／min進(jìn)行脫色試驗(yàn)，測(cè)得脫色液的透光率為93.5%，優(yōu)于正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)的透光率，所以所得的最佳脫色工藝合理。同時(shí)采用最佳脫色工藝進(jìn)行二次脫色時(shí)，脫色液的透光率可達(dá)99.5%，達(dá)到了濃縮的要求。

3.4 提取試驗(yàn)結(jié)果與產(chǎn)品質(zhì)量分析

利用陶瓷膜過(guò)濾器可以有效地去除發(fā)酵液中的菌體和大分子蛋白，過(guò)濾液透光率56.7%。鈣鹽沉淀法可以去除大量的，過(guò)濾液透光率為61.8%。利用減壓驅(qū)氨可以去除溶液中大量的NH4＋，最后再進(jìn)行活性炭脫色可以有效地除去色素和其他雜質(zhì)，脫色液的透光率可達(dá)99.5%。

表4 提取試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The experiment results of recovery

表5 D－丙氨酸成品質(zhì)量Tab.5 The product product quality of D－alanine

4 結(jié) 論

利用陶瓷膜過(guò)濾、鈣鹽沉淀、減壓驅(qū)氨、活性炭脫色等工藝從D－丙氨酸發(fā)酵液中提取出D－丙氨酸，并對(duì)工藝進(jìn)行了研究。陶瓷膜過(guò)濾能有效地除去菌體和大分子蛋白，D－丙氨酸的平均收率為98.55%。通過(guò)鈣鹽沉淀法有效地除去了料液中的，利用減壓驅(qū)氨除去了料液中的NH4＋，再利用活性炭脫色能夠很好地去除色素和其他雜質(zhì)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了最佳的脫色條件是：活性炭的添加量為0.75%、脫色溫度95℃、脫色時(shí)間70min、攪拌轉(zhuǎn)速200r／min。脫色液經(jīng)過(guò)濃縮結(jié)晶、離心分離、烘干后得到D－丙氨酸成品，總提取率平均為68.11%。D－丙氨酸成品的質(zhì)量符合日本味之素企業(yè)(AJI97)標(biāo)準(zhǔn)。最終確定了D－丙氨酸提取工藝的合理性。

[1]宋小平，韓長(zhǎng)日.香料與食品添加劑制造技術(shù)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2000：494.

[2]張曉斌.生物酶不對(duì)稱(chēng)氧化法制D－丙氨酸[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2011，36(4)：37－39.

[3]蔣瀅.氨基酸的應(yīng)用[M]，北京：世界圖書(shū)公司，1996：154.

[4]蔣木庚，張湘寧，蔣昊峰，等.DL－氨基酸和二肽甜味劑產(chǎn)業(yè)化技術(shù)[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(1)：106－110.

[5]楊海燕，張日生.阿力甜——性質(zhì)優(yōu)良的甜味劑[J].中國(guó)食品添加劑，2000，11(3)：23－25.

[6]王穎，李云政.D－丙氨酸的用途及制備方法[J].遼寧化工，2003，32(2)：58－60.

[7]金字興，韋萍.化學(xué)酶法制備D－丙氨酸的研究[C]／／第九屆全國(guó)生物化工學(xué)術(shù)會(huì)議論文集.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：304－306.

[8]SCHMITZBERGER F，KILKENNY M L，LOBLEY M E.Structural constraints on protein self－processing in L－aspartate－alpha－decarboxylase [J].European Molecular Biology Organization Journal，2003，22(23)：6193－6204.

[9]高大響，李兆蘭，焦慶才.刺孢小克銀漢霉氨基?；覆鸱諨L－丙氨酸的研究[J].氨基酸和生物資源，2005，27(2)：38－41.

[10]姚文兵，吳梧桐，金建勤，等.豬腎和牛腎氨基?；覆鸱諨L－Ala及制備D－Ala的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，28(6)：358－361

[11]姚文兵，侯振清，吳梧桐，等.固定化牛腎氨基酰化酶拆分法制備D－丙氨酸[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31(4)：297－300.

[12]王曉平，劉一鳴，王麗娟，等.米曲氨基?；傅募兓肮潭ɑ阜ú鸱諨L－丙氨酸[J].吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1998，10(4)：81－84.

[13]ISAO U，KOJI Y A，SABURO K，et al.D－alanine production from DL－alanine byCandidamaltosawith asymmetric degrading activity[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1992，36(6)：722－726.

[14]蔣光玉，章暉，劉洋，等.基于微生物同化作用的D－丙氨酸生產(chǎn)工藝研究[J].氨基酸和生物資源，2010，32(4)：41－45.