于 學(xué) 斌，王 偉，王 晉，李 懋，俞 志 敏

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)，北京 100833)

0 引 言

啤酒在生產(chǎn)過程中存在細(xì)菌污染是一種很難避免又影響產(chǎn)品質(zhì)量的嚴(yán)重問題。準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)和鑒定出啤酒中的污染菌不僅能保證啤酒的優(yōu)良品質(zhì)，還能體現(xiàn)出生產(chǎn)廠家所具有的領(lǐng)先的技術(shù)水平。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)的快速發(fā)展，檢測(cè)手段也日新月異，目前應(yīng)用范圍最廣、檢測(cè)周期最短、效果最好的是PCR方法。由于成品啤酒中所存在的菌體數(shù)量極少，一般不能達(dá)到PCR檢測(cè)的最低濃度要求，所以在PCR之前的預(yù)富集培養(yǎng)過程就成為必不可少的關(guān)鍵步驟[1]。

目前國(guó)內(nèi)啤酒行業(yè)對(duì)污染菌的檢測(cè)多使用MRS、NBB和UBA等經(jīng)典配方培養(yǎng)基，采用平板培養(yǎng)的方法，要在短時(shí)間內(nèi)迅速增菌，效果其實(shí)并不理想。對(duì)培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件優(yōu)化，可以使增菌效果大大增強(qiáng)。一般的優(yōu)化設(shè)計(jì)多采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方法，但是在存在多個(gè)因素時(shí)，要求的試驗(yàn)次數(shù)較多，而且試驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)誤差較大的結(jié)論。本試驗(yàn)首先利用單因素試驗(yàn)，選擇出不同因素的最優(yōu)條件，再利用響應(yīng)面[2－3]試驗(yàn)獲得最佳試驗(yàn)方案和最優(yōu)值。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

植物乳酸桿菌(LactobacillusplantarumXLL 0095)，從腐敗啤酒中分離篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ) MRS培養(yǎng)基[4](g／L)：麥芽糖5，葡萄糖20，酵母浸粉4，牛肉膏8，蛋白胨10，乙酸鈉5，磷酸氫二鉀2，檸檬酸三銨2，七水硫酸鎂0.2，四水硫酸錳0.05；Tween－80 1mL／L，pH 6.0。

NBB培養(yǎng)基(g／L)：酪蛋白胨5，酵母浸粉5，牛肉膏2，乙酸鉀6，磷酸氫二鈉2，L－半胱胺酸鹽酸鹽0.2，葡萄糖15，麥芽糖15，L－蘋果酸0.5，瓊脂20；Tween－80 0.5mL／L，氯酚紅70mL／L(0.022g／L)，V(啤酒)∶V(蒸餾水)＝1∶1(共1 000mL)，終pH 5.8。

改良 MRS培養(yǎng)基(g／L)：麥芽糖6.25，葡萄糖25，酵母浸粉9.1，牛肉膏18.2，蛋白胨22.75，乙酸鈉5，磷酸氫二鉀2，檸檬酸三銨2，七水硫酸鎂0.2，四水硫酸錳0.05；Tween－80 1mL／L，pH 6.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

菌種保藏方法：培養(yǎng)基(NBB)斜面，4℃保藏。

菌種活化：從斜面上挑取數(shù)環(huán)菌落，轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)MRS平板上，30℃厭氧培養(yǎng)36～48h。

1.2.2 菌體濃度測(cè)定

取樣品液體培養(yǎng)菌液3mL于7mL離心管中，8 000r／min、4 ℃、5min離心棄上清，用去離子水洗滌并充分振蕩，重復(fù)一次，用3mL去離子水重懸，用1mL菌液潤(rùn)洗玻璃比色皿杯，再取菌液1.5mL用722型可見光分光光度計(jì)在600nm比色，測(cè)吸光值[5]。

1.2.3 種子液制備

將基礎(chǔ)MRS平板上活化好的純菌落挑取數(shù)環(huán)于無菌水中，添加適量滅菌0.45mm玻璃珠漩渦振蕩混勻，取適量體積液體測(cè)量OD600吸光值，最后再通過添加適量菌體或無菌水使之達(dá)到OD600＝0.2。

1.3 單因素試驗(yàn)

應(yīng)用改良MRS液體培養(yǎng)基，接種量為10%(體積比，OD600＝0.2菌液)的條件下，探尋搖床轉(zhuǎn)速、pH、生長(zhǎng)因子(蘑菇汁)添加量對(duì)24h菌體濃度的影響。

1.4 Box－Behnken設(shè)計(jì)

根據(jù)“1.3”試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用RSA法優(yōu)化菌體富集條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

搖床轉(zhuǎn)速分別取100、120、140、150、160r／min，30℃初始培養(yǎng)基pH培養(yǎng)24h測(cè)定OD600，結(jié)果見圖1。由圖1可知，搖床轉(zhuǎn)速在150r／min時(shí)為最佳條件，菌體OD600達(dá)到最大，為1.456。

圖1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of incubator speed on bacteria growth

2.1.2 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH 為4.5、5.0、5.5、6.2、7.0，30℃恒溫靜止培養(yǎng)24h測(cè)定OD600，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH為6.2時(shí)對(duì)增菌最有利，菌體OD600最大，為0.788。

圖2 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH on bacteria growth

2.1.3 生長(zhǎng)因子對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

在改良MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加土豆汁(T)、胡蘿卜汁(H)、番茄汁(Q)、蘑菇汁(M)、玉米漿(Y)、甜麥汁(W)、蜂蜜(F)(添加量為10%)與空白試驗(yàn)(none)，30℃恒溫靜止培養(yǎng)，pH為初始條件下24h測(cè)定OD600數(shù)值，結(jié)果見圖3。根據(jù)文獻(xiàn)[7]選出增菌效果較好的幾種物質(zhì)。由圖3可知，蘑菇汁為生長(zhǎng)因子時(shí)增菌效果最好，菌體OD600最大，為1.474。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加其他添加物如果蔬汁[8－10]、激素類物質(zhì)[11－13]、低聚糖、蛋白水解物等物質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)起到非常明顯的促進(jìn)作用。

圖3 不同營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different nutrition factor on bacteria growth

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果所確定的最佳反應(yīng)條件，采用二次回歸通用旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)(三因素三水平)試驗(yàn)(表1)，其中(－1)為三水平單因素試驗(yàn)最優(yōu)條件，(0)、(1)為高水平，采用適當(dāng)?shù)谋稊?shù)；考查的響應(yīng)值Y為24h時(shí)OD600。目標(biāo)菌體生長(zhǎng)因素響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 富集試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Table of factors and levels of enrichment experiment

利用Minitab 15.0軟件對(duì)各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得回歸模型方程：Y＝－399.503＋4.1086 7X1＋18.294 2X2＋300.340X3－0.012 481 7X12－0.947 416X22－800.267X32－0.025 871 0X1X2－0.748X1X3＋0.335 484X2X3。該方程表明響應(yīng)值與所選3個(gè)因素線性關(guān)系顯著，即試驗(yàn)方法可靠[14－15]。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，驗(yàn)證回歸模型進(jìn)行顯著性檢測(cè)，結(jié)果見表3、4?？梢钥闯觯换ロ?xiàng)外都對(duì)Y是顯著或極顯著影響，說明響應(yīng)值與試驗(yàn)因子之間的關(guān)系是線性關(guān)系。

表2 富集試驗(yàn)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The enrichment experimental results of RSA

表3 回歸方程回歸系數(shù)的估計(jì)值Tab.3 The value of regression coefficient in regression equation

表4 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析Tab.4 Result analysis of Box－Behnken experiments

運(yùn)用Minitab 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得出曲面圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH、生長(zhǎng)因子、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)24hOD600的影響Fig.4 Influence of pH，growth factor and incubator speed on 24hOD600numerical

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

響應(yīng)值(Y)最大值時(shí)各因子水平為：X1＝153.232，X2＝7.577 78，X3＝0.117 677。對(duì)應(yīng)的最佳培養(yǎng)條件為：搖床轉(zhuǎn)速153r／min，pH 7.57，生長(zhǎng)因子11.8%，在此條件下預(yù)測(cè)的最大值為2.264 68。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到24hOD600為2.215，與模型預(yù)測(cè)值相差2%，與理論值基本相符。

3 結(jié) 論

討論了不同條件對(duì)啤酒腐敗菌增菌影響，確定了最優(yōu)反應(yīng)條件組合為：搖床轉(zhuǎn)速153r／min，pH 7.57，生長(zhǎng)因子11.8%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到24h時(shí)OD600為2.215，與模型預(yù)測(cè)值相差2%，該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。在響應(yīng)面法的最佳培養(yǎng)條件下，菌體生長(zhǎng)較優(yōu)化前24hOD600(0.786)提高了1.4，增幅為182%。

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