王 緲，王 際 輝，龐 宇 辰，王 晗，肖 珊，趙 小 余

(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是由亞油酸(linoleic acid，LA)衍生的共軛雙烯酸的多種位置和幾何異構(gòu)體的總稱，具有多種生理功能[1]。CLA天然存在于反芻動(dòng)物乳脂和肉中，但其含量相對(duì)較低[2]。目前，合成CLA的方法主要有化學(xué)合成法與生物合成法。微生物(如丙酸菌和乳酸菌等)能通過亞油酸異構(gòu)酶將LA轉(zhuǎn)化為CLA[3]，而混菌培養(yǎng)能夠利用不同菌株作用效果的差異，互利共棲，相比單一菌株，明顯提高了轉(zhuǎn)化能力[4]。而亞油酸異構(gòu)酶是受LA誘導(dǎo)而產(chǎn)生的[5]，不同微生物在誘導(dǎo)下產(chǎn)生代謝產(chǎn)物受營(yíng)養(yǎng)供給影響。因此本實(shí)驗(yàn)采用混菌誘導(dǎo)培養(yǎng)為基礎(chǔ)，既利用嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌間的共生作用，使其產(chǎn)酶能力高于單一菌株，又以菌株的完整細(xì)胞為亞油酸異構(gòu)酶的載體，消除LA對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制作用[6]；對(duì)其合成CLA的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行研究，以提高CLA產(chǎn)率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)以及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)室保留的嗜酸乳桿菌(La)、植物乳桿菌(Lp)；MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基[7]；紅花油水解液的乳化液；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)方法

菌種(嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌)在5mL的MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化2次，按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接入100mL的MRS培養(yǎng)基中(混菌誘導(dǎo)中，菌種體積比為1∶1)，并添加體積分?jǐn)?shù)為0.5%的底物(紅花油水解液的乳化液)，37℃靜置培養(yǎng)24h。

1.2.2 完整細(xì)胞的制備

將發(fā)酵液離心，收集細(xì)胞，加入15mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)進(jìn)行洗滌，并加入750μL無水乙醇作為透性化試劑，以使乳化后的LA能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)行二次離心，收集細(xì)胞備用。向離心管中加入一定量磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，使細(xì)胞濃度為0.05g／mL，混勻，制成懸濁液備用。

1.2.3 完整細(xì)胞生物合成CLA

在5mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中加入100μL底物(2%)和混菌完整細(xì)胞懸濁500μL(10%)，混勻，37℃搖床培養(yǎng)(135r／min)24h。

1.2.4 CLA的提取及檢測(cè)方法

取一定量的反應(yīng)液用氯仿－甲醇(V(CH3Cl3)∶V(CH3OH)＝2∶1)進(jìn)行萃取，冷凍離心，去除上層水層后，下層有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)脫除溶劑(30℃)，將殘留物用正己烷溶解，紫外233nm下進(jìn)行檢測(cè)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌完整細(xì)胞與混菌完整細(xì)胞的比較

由圖1可看出，由混菌完整細(xì)胞得到的CLA合成量明顯高于單菌完整細(xì)胞，這也許是因?yàn)閮煞N菌(Lp與La)存在共生作用，在一定的底物誘導(dǎo)下，提高了菌體的產(chǎn)酶能力，產(chǎn)生的亞油酸異構(gòu)酶比單菌多，而微生物(如丙酸菌和乳酸菌等)能通過亞油酸異構(gòu)酶將LA轉(zhuǎn)化為CLA，從而提高了CLA的合成量。

圖1 單菌與混菌完整細(xì)胞的CLA合成量Fig.1 The production of by the whole cell of single strain and the coculture of La and Lp

2.2 誘導(dǎo)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)條件

2.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中碳源的選擇

分別以質(zhì)量濃度為20g／L的果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的唯一碳源。由圖2可看出，以葡萄糖作唯一碳源時(shí)，CLA合成量最大，這也許是因?yàn)槠咸烟鞘腔罴?xì)胞的能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物，易被微生物吸收利用。因此選用葡萄糖為最優(yōu)碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同碳源對(duì)CLA生物合成的影響Fig.2 Effect of carbon sources on the biosynthesis of CLA

2.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中碳源的質(zhì)量濃度

以優(yōu)化后的碳源作為誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源，碳源質(zhì)量濃度為5～25g／L。由圖3可看出，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度小于20g／L時(shí)，CLA的合成量隨葡萄糖的質(zhì)量濃度增大而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度大于20g／L時(shí)，CLA合成量降低。這也許是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的葡萄糖增加時(shí)，微生物可以利用其作為能源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，但當(dāng)葡萄糖濃度過高時(shí)，反而會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，所以培養(yǎng)基中葡萄糖的最適質(zhì)量濃度為20g／L。

圖3 葡萄糖對(duì)CLA生物合成的影響Fig.3 Effect of glucose on the biosynthesis of CLA

2.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中氮源的選擇

分別以15g／L的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的唯一氮源。由圖4可看出，當(dāng)分別選擇蛋白胨、酵母膏、牛肉膏作為唯一氮源時(shí)，CLA合成量較低，可能是因?yàn)閱我坏粗械匦问絾我?，影響微生物的生長(zhǎng)代謝。所以在接下來的試驗(yàn)中選擇復(fù)合氮源，并對(duì)其配比進(jìn)行優(yōu)化，以提高CLA的合成量。

圖4 不同氮源對(duì)CLA生物合成的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on the biosynthesis of CLA

2.2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中復(fù)合氮源的配比

在優(yōu)化了碳源的MRS培養(yǎng)基中，添加不同質(zhì)量濃度的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏，添加因素水平如表1。

表1 復(fù)合氮源配比正交因素水平表Tab.1 The ratio of complex nitrogen sources

由表2可見，影響完整細(xì)胞生物合成CLA的因素主次依次為A＞C＞B，即蛋白胨＞酵母膏＞牛肉膏，3種因素的最優(yōu)組合為A3B2C1，即蛋白胨15g／L，牛肉膏5g／L，酵母膏5g／L。

表2 復(fù)合氮源正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Tab.2 Design and result of complex nitrogen sources orthogonal text

2.2.5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無水乙酸鈉的質(zhì)量濃度

在優(yōu)化了碳源和氮源的MRS培養(yǎng)基中，添加無水乙酸鈉(0～10g／L)。由圖5可看出，無水乙酸鈉為7.5g／L時(shí)，CLA合成量最大。當(dāng)無水乙酸鈉濃度較低時(shí)可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)代謝，濃度過高則會(huì)使細(xì)胞滲透壓失去平衡，從而抑制菌體生長(zhǎng)，影響代謝，使CLA合成量降低。

圖5 無水乙酸鈉對(duì)CLA生物合成的影響Fig.5 Effect of sodium acetate on the biosynthesis of CLA

2.2.6 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中吐溫－80的質(zhì)量濃度

在優(yōu)化了碳源、氮源和無水乙酸鈉的MRS培養(yǎng)基中，添加吐溫－80(0～2g／L)。吐溫－80濃度增加時(shí)，CLA合成量增加，濃度過高時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞膜，抑制菌體生長(zhǎng)代謝。由圖6可看出，吐溫－80的質(zhì)量濃度為1.5g／L時(shí)CLA合成量達(dá)到最高。

圖6 吐溫－80對(duì)CLA合成的影響Fig.6 Effect of tween－80on the biosynthesis of CLA

2.2.7 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的選擇

由圖7可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加單一的無機(jī)鹽時(shí)，CLA合成量均較低，所以應(yīng)添加多種無機(jī)鹽，以滿足微生物生長(zhǎng)需求。

圖7 不同無機(jī)鹽對(duì)CLA合成的影響Fig.7 Effect of inorganic salts on the biosynthesis of CLA

2.2.8 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的配比

在優(yōu)化的MRS培養(yǎng)基中，添加不同質(zhì)量濃度的檸檬酸二銨、K2HPO4、MgSO4、MnSO4，添加因素水平如表3。

表3 無機(jī)鹽配比正交因素水平表Tab.3 The ratio of composite inorganic salts

從表4可以看出，影響完整細(xì)胞生物合成CLA的因素主次依次為B＞A＞D＞C，即K2HPO4＞檸檬酸二銨＞MnSO4＞MgSO4，這也許是因?yàn)镵2HPO4可作為磷源，利于菌體的生長(zhǎng)代謝。四因素的最優(yōu)組合為A3B3C2D3。

表4 無機(jī)鹽配比正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Tab.4 Design and result of composite inorganic salts orthogonal text

3 結(jié) 論

對(duì)混菌完整細(xì)胞生物合成共軛亞油酸的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行研究，得到如下結(jié)果：在 MRS培養(yǎng)基中，葡萄糖20g／L，蛋白胨15g／L，牛肉膏5g／L，酵母膏5g／L，無水乙酸鈉7.5g／L，吐溫－80 1.5g／L，檸檬酸二銨3g／L，K2HPO43.93g／L，MgSO40.58g／L，MnSO40.3g／L。在優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，CLA合成量為81.38μg／mL，比使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)的CLA合成量增加了11.34μg／mL。

[1]BRODIE A E，MANNING V A.Conjugated linoleic acid inhibits differentiation of pre－and post－confluent 3T3－L1preadipocytes but inhibits cell proliferation only in preconfluent cells[J].The Journal of Nutrition，1999，129(3)：602－606.

[2]CHIN S F，STORKSON J M，LIU W，et al.Conjugated linoleic acid (9，11－and 10，12－octadecadienoic acid)is produced in conventional but not germ－free rats fed linoleic acid[J].The Journal of Nutrition，1994，124(5)：694－701.

[3]COAKLEY M，ROSS R P，NORDGREN M，et al.Conjugated linoleic acid biosynthesis by human－derivedBifidobacteriumspecies[J].Journal of Applied Microbiology，2003，94(1)：138－145.

[4]徐穎宣，徐爾尼，馮乃憲，等.微生物混菌發(fā)酵應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國釀造，2008(9)：1－4.

[5]KISHINO S，OGAWA J，OMURA Y，et al.Conjugated linoleic acid production from linoleic acid by lactic acid bacteria[J].Journal of the American Oil Chemists Society，2002，79(1)：159－163.

[6]LEE S O，KIM S K，CHO K S，et al.Bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid during fermentation and by washed cells ofLactobacillusreuteri[J].Biotechnology Letters，2003，25(12)：935－938.

[7]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：85－129.

[8]于田，王際輝，龐宇辰，等.嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌混菌發(fā)酵合成共軛亞油酸的動(dòng)力學(xué)[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32(1)：11－14.(YU Tian，WANG Jihui，PANG Yuchen，et al.Kinetics of conjugated linoleic acid by mixed strains ofLactobacillusacidophilusandStreptococcusthermophilus[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2013，32(1)：11－14.)