譚 廣 毅，叢 麗 娜，姜 啟 晨，盧 冬

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

溶菌酶(又稱胞壁質(zhì)酶)是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，屬于α－乳白蛋白家族，廣泛存在于動物、植物、細菌、噬菌體中[1]。目前，根據(jù)溶菌酶空間結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)特性和催化活性的差異通?？煞譃?類：雞型溶菌酶、無脊椎動物溶菌酶、鵝型溶菌酶、植物溶菌酶、細菌溶菌酶、T4噬菌體溶菌酶[2]。其中，c型溶菌酶分布最為廣泛，脊椎動物、無脊椎動物和原索動物中均有發(fā)現(xiàn)，其中禹紹國等[3－4]從奧里亞羅非魚中克隆出了3種c型溶菌酶基因。

目前國內(nèi)外重組溶菌酶的研究主要集中在c型人溶菌酶以及c型和i型水產(chǎn)動物溶菌酶[5]。而c型水產(chǎn)動物溶菌酶對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤其是蝦類的養(yǎng)殖意義非凡。但是迄今為止，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)重組水產(chǎn)動物溶菌酶尚未見報道。重組中國明對蝦溶菌酶的生產(chǎn)目前主要存在的問題：首先是重組對蝦溶菌酶基因在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達，其溶菌酶蛋白多以包涵體形式存在，后續(xù)對其變性和復(fù)性操作繁瑣，獲得的酶產(chǎn)量低、活性不穩(wěn)定；其次是重組對蝦溶菌酶在畢赤酵母真核表達系統(tǒng)蛋白表達量很低[6]。這些問題嚴重阻礙了中國明對蝦溶菌酶研究向產(chǎn)業(yè)化試驗的進程。通過對中國明對蝦溶菌酶基因結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，中國明對蝦溶菌酶成熟肽(140個氨基酸)具有一個完整的結(jié)構(gòu)域，包括c型溶菌酶的活性中心(Glu33和Asp50)，以及8個保守Cys殘基；同時，中國明對蝦溶菌酶成熟肽疏水性較高，且N端和C端含多個疏水性氨基酸[7－10]。因此，本研究將中國明對蝦溶菌酶成熟肽N端和C端個別疏水性氨基酸經(jīng)點突變[11]改為親水性氨基酸，以誘導(dǎo)其溶菌酶蛋白的可溶性表達。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 酶類及主要試劑

T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、DNA Marker，購自TaKaRa Biotechnology公司(大連)；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒，購自天根生物技術(shù)公司；其他SDS－PAGE電泳試劑、細菌培養(yǎng)試劑等為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌表達系統(tǒng)Rosetta(DE3)、表達載體pET－39b(＋)購自 Novagen公司；重組克隆質(zhì)粒pMD18－T－FcLys、基因工程菌pET－39b(＋ )－FcLys／Rosetta(DE3)由本實驗室構(gòu)建保存。

1.2 方 法

1.2.1 點突變設(shè)計方案

通過對中國明對蝦溶菌酶成熟肽(140個氨基酸)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其疏水性偏大且疏水性氨基酸多分布于兩端。在不改變活性中心、不影響二硫鍵形成等前提下，首先挑選該序列兩端個別疏水性氨基酸突變?yōu)橛H水性氨基酸，即將該成熟肽氨基酸序列N端的第2號位的纈氨酸(GTC)突變?yōu)楦拾彼?GGC)，第3號位的苯丙氨酸(TTC)突變?yōu)榻z氨酸(TCC)；再將成熟肽C端第137號位異亮氨酸(ATA)突變?yōu)榫彼?AGA)，第138號位苯丙氨酸(TTC)突變?yōu)槔野彼?TAC)，最后一位的苯丙氨酸(TTC)突變?yōu)榻z氨酸(TCC)。通過以下設(shè)計特異性引物，經(jīng)PCR擴增，預(yù)期得到中國明對蝦溶菌酶點突變(FcLysM)基因片段，最終目標為表達可溶性重組突變對蝦溶菌酶蛋白，以期解決對蝦溶菌酶高效表達中存在表達產(chǎn)物不溶性的瓶頸問題。

1.2.2 引物設(shè)計

以實驗室保存重組克隆質(zhì)粒pMD18－TFcLys為模板，根據(jù)表達載體pET－39b(＋)特性及“1.2.1”討論的原則等，進行引物設(shè)計。上游引物引入酶切位點NcoⅠ，下游引物引入酶切位點XhoⅠ。(下劃線表示引入的酶切位點、小寫字母表示點突變基因)

表1 FcLysM特異性引物Tab.1 Specific primer of FclysM

1.2.3 FcLysM基因的擴增

以重組克隆質(zhì)粒pMD18－T－FcLys為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為(50μL反應(yīng)體系)：94℃30s、60℃30s、72℃1min共30個循環(huán)；72℃10min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。擴增得到的PCR產(chǎn)物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳割膠回收，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組表達系統(tǒng)pET－39b(＋)－FcLysM／Rosetta(DE3)的構(gòu)建

將回收純化的PCR擴增產(chǎn)物與克隆載體pMD18－T連接，構(gòu)建pMD18－T－FcLysM 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，經(jīng)篩選鑒定得到陽性克隆菌株。液體培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒pMD18－T－FcLysM，使用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，將回收的目的片段與使用相同酶酶切處理的原核表達載體pET－39b(＋)定向連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET－39b(＋)－FcLysM，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中。再提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR和酶切驗證后，篩選得到的陽性克隆菌株通過DNA測序鑒定其正確性。最后，將重組質(zhì)粒與空白質(zhì)粒pET－39b(＋)分別轉(zhuǎn)入E.coli感受態(tài)細胞Rosetta(DE3)，涂布于含有100μg／mL卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。

1.2.5 重組蛋白FcLysM的誘導(dǎo)表達

將測序鑒定正確的陽性單克隆表達菌株和陰性對照菌株接種于LB／Kan液體培養(yǎng)基中，37℃、160r／min過夜振蕩培養(yǎng)。再以1∶100的比例將種子液接種于200mL LB／Kan液體培養(yǎng)基中，37℃、160r／min 培養(yǎng)約2.5h，OD600值達到0.5～0.6。取出1mL菌液作為誘導(dǎo)前對照樣品，再加入終濃度為1.0mmol／L的IPTG，25℃、150r／min誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，取出1mL菌液作為誘導(dǎo)后樣品，其余發(fā)酵誘導(dǎo)菌液經(jīng)10 000r／min離心15min，收集菌體細胞。將收集的菌體重懸于20mL預(yù)冷的含20mmol／L的Tris－HCl緩沖液中(pH 8.0)，加入終質(zhì)量分數(shù)1%的 Triton X－100，冰浴中進行超聲破碎細胞(破碎時間1s，間歇時間3s，總時間20min)。超聲破碎后離心菌液(4℃、12 000r／min、15min)，分別收集上清液和沉淀。用12%的SDS－PAGE電泳檢測。

1.2.6 重組蛋白FcLysM與FcLys可溶性表達量對比

發(fā)酵、誘導(dǎo)表達、細胞破碎條件同“1.2.4”。分別取FcLysM與FcLys超聲破碎菌體上清液樣品，用12%的SDS－PAGE電泳檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 FcLysM成熟肽基因的擴增和表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的重組質(zhì)粒pMD18－T－FcLys為模板，由特異性引物Fc－1和Fc－2進行PCR擴增，經(jīng)檢測分析擴增出的FcLysM成熟肽基因，在440bp左右有清晰亮帶，與預(yù)測大小一致。經(jīng)序列測定，該擴增的FcLysM成熟肽基因片段為420bp。將已得到的pMD18－T－FcLysM 質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，結(jié)果出現(xiàn)與預(yù)測目的片段和載體大小一致的條帶(圖1)，測序后驗證了該重組表達質(zhì)粒中目的基因序列的正確性，這表明重組表達質(zhì)粒pET－39b(＋)－FcLysM構(gòu)建成功。

圖1 成熟肽點突變基因(FcLysM)的擴增和酶切驗證Fig.1 Amplification and identification of FcLysM

2.2 重組蛋白FcLysM的表達

將已構(gòu)建的重組基因工程菌pET－39b(＋)－FcLysM／Rosetta(DE3)和陰性對照菌株 pET－39b(＋)／Rosetta(DE3)，使用IPTG作為誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)12%的SDS－PAGE電泳檢測，陰性對照菌株誘導(dǎo)后樣品與誘導(dǎo)前樣品比較，前者在25.0ku處產(chǎn)生一條特異性亮帶，而FcLysM工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后的樣品則在43.0ku處明顯出現(xiàn)了一條特異性電泳亮帶(圖2)。經(jīng)預(yù)測軟件Bandscan掃描分析，該融合蛋白表達量達到菌體總蛋白含量的90%以上，這表明FcLysM在此基因工程菌體系中得到了高效表達。另外，F(xiàn)cLysM基因編碼140個氨基酸，經(jīng)ExPASy預(yù)測分子質(zhì)量為15.3ku，而pET－39b(＋)載體上融合 表 達 的 幾 個 標 簽 蛋 白，His－Tag、DsbA、S－Tag等序列分子質(zhì)量為28.1ku左右，因此，計算該重組蛋白FcLysM的分子質(zhì)量應(yīng)為43.0ku左右，電泳圖上的實驗結(jié)果與理論計算相符合。

圖2 FcLysM重組菌株誘導(dǎo)表達Fig.2 Expression of pET－39b(＋)－FcLysM／Rosetta(DE3)

2.3 重組蛋白FcLysM與FcLys表達可溶性比較

將已構(gòu)建的重組基因工程菌pET－39b(＋)－FcLysM／Rosetta(DE3)(重組點突變對蝦溶菌酶基因工程菌)和實驗室保存的基因工程菌pET－39b(＋)－FcLys／Rosetta(DE3)(重 組 對 蝦溶菌酶基因工程菌)，使用IPTG作為誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達。分別取超聲破碎菌體的上清液樣品，經(jīng)12%的SDS－PAGE電泳檢測，兩樣品均在43.0ku處出現(xiàn)明顯條帶(圖3)。經(jīng)預(yù)測軟件Bandscan掃描分析，點突變重組蛋白FcLysM可溶性表達量約占上清液總蛋白量的51.9%，非重組蛋白FcLys可溶性表達量約占上清液總蛋白量的23.2%，突變后可溶性表達量增加一倍，基本達到實驗?zāi)康摹?/p>

圖3 重組蛋白FcLysM與FcLys可溶性比較Fig.3 Comparative FcLysM and FcLys

3 結(jié) 論

本研究成功擴增出中國明對蝦溶菌酶的成熟肽點突變基因，并構(gòu)建了重組中國明對蝦溶菌酶原核表達質(zhì)粒pET－39b(＋)－FcLysM。

誘導(dǎo)表達中國明對蝦溶菌酶點突變基因的重組工程菌株pET－39b(＋ )FcLysM／Rosetta(DE3)，得到重組的FcLysM 蛋白，經(jīng)預(yù)測軟件Bandscan掃描分析，表達量達到菌體總蛋白的90%左右，實現(xiàn)了中國明對蝦重組點突變?nèi)芫傅母咝П磉_。

中國明對蝦溶菌酶點突變重組蛋白FcLysM可溶性表達量高出非點突變重組蛋白FcLys可溶性表達量一倍，這個結(jié)果將大大簡化了重組蛋白的后續(xù)純化工藝。同時，對中國明對蝦溶菌酶點突變重組蛋白FcLysM的抑菌活性進行了初步探究，其抑菌活性與非點突變重組蛋白FcLys的抑菌活性幾乎相同。這個結(jié)論為利用基因點突變技術(shù)研究可溶性蛋白表達提供了有意義的探索。

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