李 江，葉 淑 紅，王 際 輝，王 晗，肖 珊

(大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116034)

0 引 言

海洋假單胞菌屬于海洋細(xì)菌，由于其特殊的生存環(huán)境，使其產(chǎn)生的胞外多糖結(jié)構(gòu)新穎，功能獨(dú)特，活性豐富，是開發(fā)多糖類海洋功能食品的重要資源[1]。硒是生命必需的微量元素，它可以直接或間接地清除體內(nèi)氧自由基，并且能夠抑制腫瘤、心血管等疾病的發(fā)生[2]。但由于無(wú)機(jī)硒毒性強(qiáng)，應(yīng)用受到限制。因此急需尋找一種生物活性高且毒性低的有機(jī)硒化合物。據(jù)報(bào)道，多糖硒的配合物作為補(bǔ)硒劑不僅具有穩(wěn)定性和溶解性能，而且釋放出硒后配體多糖不會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生任何毒副作用[3]。劉振鋒等[4]研究硒多糖具有抗腫瘤、抗氧化、提升機(jī)體免疫力、拮抗重金屬蓄積、抗病毒等多種藥理活性。國(guó)外對(duì)硒多糖的研究很少。本實(shí)驗(yàn)以海洋細(xì)菌假單胞菌PT－8發(fā)酵產(chǎn)胞外硒多糖，并對(duì)該硒多糖的流變性進(jìn)行了研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌 種

假單胞菌PT－8，由作者所在實(shí)驗(yàn)室自深海海泥中分離、鑒定并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖5，牛肉膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂1.5%～2%。

種子培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖5，蛋白胨10，氯化鈉5，牛肉膏3。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：蔗糖35，牛肉膏20，氯化鈉55，K2HPO41，MgSO41，KH2PO40.5，MnSO40.5，pH 7.5。

1.1.3 試劑與儀器

主要試劑：苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇等，均為分析純。

主要儀器：真空冷凍干燥機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、SNB－1數(shù)字式黏度計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富硒實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 加硒濃度的確定

從斜面上挑取菌種，于含Na2SeO3量分別為0～50μg／mL的液體培養(yǎng)基中，根據(jù)所測(cè)得的生物量及硒多糖產(chǎn)量確定適宜硒濃度。

1.2.1.2 最佳加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間的確定

通過測(cè)定耐硒菌生長(zhǎng)曲線，確定最佳加硒時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間，測(cè)發(fā)酵液在600nm處吸光度值，用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量，并繪制曲線。

1.2.2 硒多糖提取純化

提取粗多糖：種子培養(yǎng)基→發(fā)酵培養(yǎng)基→發(fā)酵液離心，取上清→醇沉→離心→溶解→Sevag法除蛋白3次→醇沉→離心→溶解→透析→冷凍干燥→粗多糖。用苯酚－硫酸法測(cè)定多糖含量。

純化粗多糖：粗多糖溶液→DEAE－52，NaCl梯度洗脫(體積流量0.5mL／min)→濃縮、透析、凍干→Sephadex G－100，蒸餾水洗脫→濃縮、透析、凍干→純品多糖[5]。

1.2.3 富硒多糖含硒量的測(cè)定

采用石墨爐原子吸收法測(cè)定富硒多糖中的硒含量[6]。

1.2.4 富硒多糖流變性

1.2.4.1 濃度對(duì)多糖溶液黏度的影響

將Se－EPS和EPS配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的多糖溶液，各取30mL，用SNB－1數(shù)字式黏度計(jì)測(cè)其在室溫、40r／min條件下的黏度。

1.2.4.2 剪切力對(duì)多糖溶液黏度的影響

配制 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0% 的 Se－EPS 和EPS溶液，各取30mL，室溫下依次測(cè)定每種質(zhì)量分?jǐn)?shù)多糖溶液在轉(zhuǎn)速為30、40、50、60r／min下的黏度。

1.2.4.3 溫度對(duì)多糖溶液黏度的影響

配制8份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Se－EPS和EPS溶液，分別在30～100℃恒溫水浴鍋中保溫20min，冷卻至室溫，測(cè)定其在40r／min下的黏度。

1.2.4.4 pH對(duì)多糖溶液黏度的影響

配制9份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Se－EPS和EPS溶液，分別將pH 調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，測(cè)定其在30℃、40r／min條件下的黏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 加硒量和加硒時(shí)間的確定

2.1.1 加硒量的確定

如圖1可知，假單胞菌PT－8的吸光值隨著硒濃度的增加而降低，因此硒濃度過高將抑制菌體生長(zhǎng)，故選取Na2SeO3添加量為20μg／mL。

圖1 硒質(zhì)量濃度對(duì)生長(zhǎng)量和硒多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 The effect of concentrations of Se on growth and yield of Se－EPS

2.1.2 加硒時(shí)間的確定

如圖2所示，耐硒菌在4～14h處于對(duì)數(shù)期，至30h到達(dá)了最大，24～36h可認(rèn)為是菌株生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，42h后開始進(jìn)入衰亡期。從轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)周期考慮，選擇第6h添加硒，培養(yǎng)時(shí)間為48h。硒多糖產(chǎn)量為7.28g／L。

圖2 PT－8菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of PT－8strain

2.2 富硒多糖的硒含量

由表1可知添加Na2SeO3為20～40μg／mL的Se－EPS的含硒量相近，濃度高抑制菌體生長(zhǎng)。因此Na2SeO3質(zhì)量濃度為20μg／mL最佳。

表1 不同質(zhì)量濃度Na2SeO3所得Se－EPS的含硒量Tab.1 The selenium amount in Se－EPS of Na2SeO3 concentration

2.3 富硒多糖的流變性

2.3.1 濃度對(duì)黏度的影響

在剪切速率為40r／min時(shí)測(cè)定Se－EPS和EPS分別在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下多糖溶液的黏度，結(jié)果如圖3所示。多糖溶液的黏度會(huì)隨著濃度的升高而升高，而且硒多糖黏度始終低于多糖濃度?？赡苁怯捎谑嵌嗵堑牧u基和氨基硒化后，分子間由氫鍵產(chǎn)生的作用力變小使硒多糖的黏度變小[7]。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下胞外硒多糖和多糖黏度Fig.3 The viscosity of Se－EPS and EPS in different mass fractions

2.3.2 剪切力對(duì)黏度的影響

測(cè)定Se－EPS和EPS依次在相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同剪切速率下黏度，結(jié)果如圖4、5所示。該硒多糖和多糖均為非牛頓流體，且為假塑性流體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)硒多糖的黏度小于多糖黏度，可能是由于該多糖在硒化反應(yīng)過程中分子發(fā)生裂解，分子質(zhì)量變小使得黏度變小[8]。

2.3.3 溫度對(duì)黏度的影響

在相同剪切速率40r／min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Se－EPS和EPS溶液，在不同溫度下的黏度測(cè)定結(jié)果如圖6所示。隨著溫度的升高，Se－EPS和EPS溶液的黏度逐漸降低，表明高溫會(huì)破壞多糖原有的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖4 不同剪切速率下胞外硒多糖的黏度Fig.4 The viscosity of Se－EPS at different shear behavior

圖5 不同剪切速率下胞外多糖的黏度Fig.5 The viscosity of EPS at different shear behavior

圖6 不同溫度下胞外硒多糖和多糖黏度Fig.6 The viscosity of Se－EPS and EPS at different temperature

2.3.4 pH對(duì)黏度的影響

剪切速率為40r／min、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Se－EPS和EPS溶液在不同pH下黏度的變化如圖7所示。溶液的表觀黏度值在酸性時(shí)最大，推測(cè)該多糖是酸性多糖[9]。

圖7 不同pH下胞外硒多糖和多糖黏度Fig.7 The viscosity of Se－EPS and EPS at different pH

3 結(jié) 論

海洋假單胞菌PT－8發(fā)酵產(chǎn)胞外硒多糖與胞外多糖產(chǎn)量和流變性進(jìn)行了比較。硒多糖經(jīng)醇沉、脫蛋白、凍干得到產(chǎn)量為7.28g／L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胞外多糖的產(chǎn)量[10]。其中硒多糖純度為79.67%，并且該多糖中的硒為256.7mg／kg。同時(shí)測(cè)定了該硒多糖的黏度。孫蘭萍等[11]研究發(fā)現(xiàn)硒化后的多糖黏度降低是由于殼聚糖的羥基和氨基硒化后，分子間由氫鍵產(chǎn)生的作用力變小使硒化殼聚糖的黏度變小；另一個(gè)原因是殼聚糖在硒化反應(yīng)過程中分子發(fā)生裂解，分子質(zhì)量變小使得黏度變小。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)硒多糖的黏度低于多糖，推測(cè)可能是由于硒化后硒與多糖的結(jié)合是通過與氨基和羥基結(jié)合，分子間由氫鍵產(chǎn)生的作用力變小使硒多糖的黏度變小，也可能是多糖分子發(fā)生裂解。其具體的結(jié)合方式，有待于進(jìn)一步研究。

[1]王俊，黃明，徐幸蓮，等.硒及富硒功能食品研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003(2)：53－56.

[2]TURLO J，GUTKOWSKA B，HEROLD F.Effect of selenium enrichment on antioxidant activities and chemical composition ofLentinulaedodes(Berk.)Pegl.mycelial extracts[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48(4)：1085－1091.

[3]蔣京，廖寶涼.N－含硒殼聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性[J].廣東微量元素科學(xué)，2000，7(5)：14－17.

[4]劉振鋒，東方，季宇彬，等.硒多糖藥理活性研究進(jìn)展[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，25(4)：36－40.

[5]XU Chunlan.Preparation，characterization and immunomodulatory activity of selenium－enriched exopolysaccharide produced by bacteriumEnterobactercloacaeZ0206[J].Bioresource Technology，2008，2009(100)：2095－2097.

[6]高淑云，馬亞東.返魂草中硒多糖及硒元素含量的測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(11)：2763－2764.

[7]楊永利，郭守軍，何都能，等.鹿角海蘿多糖的流變性研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28(7)：103－106.

[8]郭守軍，楊永利，林杜鑫.龍須菜多糖的流變性研究[J].食品與機(jī)械，2009，25(4)：23－27.

[9]縱偉，王會(huì)曉，閔婉平，等.紅棗多糖黏度特性的研究[J].食品科技，2011，36(2)：69－71.

[10]孫紅梅，張星星，白玉，等.海洋假單胞菌胞外多糖的抗氧化性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31(6)：395－398.(SUN Hong－mei，ZHANG Xing－xing，Bai Yu，et al.Antioxidant effects of extracellular polysaccharides from a marinePseudomonas[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2012，31(6)：395－398.)

[11]孫蘭萍，張勝義，許暉.硒化殼聚糖的制備及理化性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27(2)：146－151.