孫 艷 紅，王 珊，侯 英 敏，孫 玉 梅

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

脂肪酶(EC3.1.1.3)能在油水界面上催化酯水解和醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成及高聚物合成等反應(yīng)，被重點(diǎn)研究和較廣泛應(yīng)用[1]。與游離酶和固定化酶相比，固定化全細(xì)胞在經(jīng)濟(jì)性、使用穩(wěn)定性及易行性等方面均具有顯著優(yōu)越[2]。

常用的細(xì)胞固定化方法有包埋法、吸附法、共價(jià)法以及交聯(lián)法等。吸附法以其操作簡(jiǎn)單、處理?xiàng)l件溫和、酶的損害作用小以及吸附劑可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌、酵母菌、真菌細(xì)胞的固定化[3－4]。活性炭、硅膠和大孔樹(shù)脂是常用的固定化載體，具有較大的孔徑和比表面積，理化性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格低廉及吸附能力強(qiáng)[4－5]。大孔弱堿性離子交換樹(shù)脂D301固定化假絲酵母脂肪酶比游離酶的酶活力提高了兩倍多，酶的固定化效率約為3.5U／(mg·h)[6]。活性炭比大孔樹(shù)脂對(duì)蛋白酶的吸附固定效果好，固定率可達(dá)61.95%，固定的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的去除率達(dá)到44.30%[7]。以氨基化硅膠固定化葡萄糖氧化酶較游離酶酶活力、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性上均有提高[5]。

本文分別以活性炭、硅膠G、大孔樹(shù)脂DM－130固定發(fā)酵性絲孢酵母細(xì)胞，研究了固定化培養(yǎng)條件，并對(duì)不同載體的固定化效果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans)CICC1368，購(gòu)自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基制備

斜面培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10，瓊脂20，自然pH，0.1MPa、121℃滅菌15min。

種子培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖100，蛋白胨5.3，酵母膏2，尿素2，MgSO40.5，自然pH，0.08MPa、115℃滅菌20min，尿素0.05MPa滅菌15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖100，酵母膏0.5，蛋白胨1.8，KH2PO42，自然 pH，0.08MPa、115℃滅菌20min。

1.1.3 固定化載體

活性炭(40目、顆粒狀)，沈陽(yáng)市新西試劑廠；大孔樹(shù)脂DM－130，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司樹(shù)脂分廠；硅膠G，青島裕民硅膠試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 載體的預(yù)處理

1.2.1.1 活性炭預(yù)處理

在1mol／L HCl溶液中加入定量40目活性炭顆粒，于50℃攪拌1h分離除酸，用去離子水多次沖洗，直至洗液pH為中性，于130℃烘干[8]。

1.2.1.2 大孔樹(shù)脂DM－130和硅膠G的預(yù)處理

用去離子水將載體清洗至無(wú)明顯雜質(zhì)后裝入30mm×480mm層析柱中，按酸(HCl 5%)－堿(NaOH 5%)－酸(HCl 5%)的順序淋洗載體3次，每一次酸洗或堿洗后，用去離子水反復(fù)沖洗至洗液pH為中性，處理后的載體于室溫干燥待用[6]。

1.2.2 游離細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

將菌種接于YEPD斜面上，于30℃培養(yǎng)72h，挑取2環(huán)活化后的菌絲接種于含100mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃、160r／min培養(yǎng)24h，得到種子液。將種子液以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)72h。將發(fā)酵液于4℃、5 000g離心10min，去除上清液，用50mmol／L、磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體3次，并離心收集。

1.2.3 固定化細(xì)胞的吸附培養(yǎng)與處理

按10%的接種量將液體種子接入到100mL含有已預(yù)處理的載體的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、160r／min培養(yǎng)，將固定化載體與發(fā)酵液過(guò)濾分離，濾得的載體用去離子水和50mmol／L磷酸緩沖液(pH 7.0)沖洗3次，風(fēng)干后得到固定化細(xì)胞[8]。

1.2.4 細(xì)胞吸附量的測(cè)定

式中：細(xì)胞質(zhì)量＝風(fēng)干的固定化細(xì)胞質(zhì)量－發(fā)酵液中載體添加量，g。

1.2.5 脂肪酶活力測(cè)定

將50mL橄欖油加入到150mL 4%聚乙烯醇溶液中，用榨汁機(jī)處理3min，置于4℃保存，使用前需重新乳化。采用酸堿滴定法測(cè)定脂肪酶活力。取50mL錐形瓶3個(gè)，分別加入4mL磷酸緩沖液和5mL底物溶液，另向空白瓶A中加入10mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，于38℃恒溫預(yù)熱5min，加入待測(cè)細(xì)胞，在38℃攪拌條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10min，向樣品瓶B、C中加入10mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇終止反應(yīng)。滴加3～5滴酚酞，用0.025mol／L NaOH溶液滴定反應(yīng)產(chǎn)生的脂肪酸。在上述反應(yīng)條件下，以每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸的所需酶量定義為1個(gè)酶活單位[9]。

1.2.6 固定化細(xì)胞的掃描電鏡觀測(cè)

將固定化細(xì)胞于130℃烘干2h，置于干燥器中保存。取形狀規(guī)則的待測(cè)樣品，采用JFC－1600AUTO FINE COATER儀在真空度8.85Pa的條件下對(duì)樣品進(jìn)行離子濺射噴Pt處理，最后用JSM－6460LV掃描電子顯微鏡觀測(cè)固定化細(xì)胞結(jié)構(gòu)并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附載體的選擇

2.1.1 吸附載體固定化時(shí)間的確定

分別以10g／L活性炭、10g／L硅膠G、10g／L大孔樹(shù)脂DM－130為載體，通過(guò)吸附培養(yǎng)的方法固定化發(fā)酵性絲孢酵母。測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下的細(xì)胞吸附量及脂肪酶活力，以游離細(xì)胞脂肪酶活力作對(duì)照，結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可知，在吸附培養(yǎng)的前48h，隨著吸附培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞吸附量逐漸增加，且3種不同載體在吸附培養(yǎng)48h時(shí)細(xì)胞吸附量均達(dá)到最大，隨后降低。其中硅膠G細(xì)胞吸附量＞活性炭細(xì)胞吸附量＞大孔樹(shù)脂DM－130細(xì)胞吸附量。

由圖2可知，活性炭及大孔樹(shù)脂DM－130作為載體時(shí)，在吸附培養(yǎng)的前48h，隨著吸附培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化細(xì)胞酶活力逐漸增加，在吸附培養(yǎng)48h達(dá)到最高，隨后逐漸降低。硅膠G作為載體時(shí)，在吸附培養(yǎng)60h達(dá)到最高，隨后逐漸降低。而游離細(xì)胞酶活力隨時(shí)間增加變化不明顯，脂肪酶活力在發(fā)酵60h達(dá)到最高。

圖1 吸附培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不同載體細(xì)胞吸附量的影響Fig.1 Effect of adsorption cultivation time on the cell adsorption quantity on various support

圖2 吸附培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不同載體固定化細(xì)胞脂肪酶活力的影響Fig.2 Effect of adsorption cultivation time on the lipase activity of immobilized cell on various support

在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，固定化細(xì)胞酶活力均高于游離細(xì)胞酶活力，呈現(xiàn)活性炭固定化細(xì)胞酶活力＞大孔樹(shù)脂DM－130固定化細(xì)胞酶活力＞硅膠G固定化細(xì)胞酶活力＞游離細(xì)胞酶活力的趨勢(shì)。以活性炭為載體固定化細(xì)胞較硅膠G及大孔樹(shù)脂DM－130對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的促進(jìn)效果更顯著，縮短了細(xì)胞的發(fā)酵周期，提高了胞內(nèi)脂肪酶活力。

2.1.2 吸附載體添加量的確定

分別以5、10、15、20g／L活性炭、硅膠 G、大孔樹(shù)脂DM－130為載體，通過(guò)吸附培養(yǎng)的方法固定化發(fā)酵性絲孢酵母，活性炭及大孔樹(shù)脂DM－130吸附培養(yǎng)48h后取樣，硅膠G吸附培養(yǎng)60h后取樣，測(cè)定其細(xì)胞吸附量及胞內(nèi)脂肪酶活力，結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可知，相對(duì)而言，大孔樹(shù)脂DM－130不利于細(xì)胞吸附，其固定化細(xì)胞的產(chǎn)酶活力低于另外兩種載體。添加量相同時(shí)，活性炭載體遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外兩種載體的細(xì)胞吸附量。當(dāng)活性炭添加量為15g／L時(shí)，其細(xì)胞吸附量達(dá)到最大，而固定化細(xì)胞酶活力的最大值卻出現(xiàn)在活性炭添加量為10g／L時(shí)。這可能是由于活性炭添加量較少，細(xì)胞吸附量過(guò)大，酶分子之間產(chǎn)生凝結(jié)作用的機(jī)會(huì)增多，易形成多層包被或皺褶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致空間傳質(zhì)阻力變大，從而使固定化細(xì)胞酶活力降低[10]。而活性炭添加量過(guò)多，單位質(zhì)量載體的細(xì)胞吸附量相對(duì)降低，相應(yīng)的酶分子較少，從而使固定化細(xì)胞酶活力降低。表明載體添加量過(guò)多或過(guò)少對(duì)細(xì)胞固定化均有負(fù)面影響。

圖3 載體添加量對(duì)細(xì)胞吸附量的影響Fig.3 Effect of support concentration on the cell adsorption quantity

圖4 載體添加量對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of support concentration on the lipase activity of immobilized cell on various support

硅膠G添加量為10g／L時(shí)，其細(xì)胞吸附量達(dá)到最大，而添加量為15g／L時(shí)，固定化細(xì)胞酶活力達(dá)到最大但細(xì)胞吸附量過(guò)小，不利于固定化細(xì)胞的重復(fù)使用。因此硅膠G適宜的添加量為10g／L。

2.1.3 吸附載體的選擇

不同吸附載體的最優(yōu)固定化條件及固定化效果如表1所示。以活性炭為載體固定化發(fā)酵性絲孢酵母，其固定化條件、細(xì)胞吸附量、酶活和比酶活均優(yōu)于另外兩種載體，并且活性炭具有安全性高、韌性好、成本低以及固定化方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此初步選用活性炭為適宜固定化載體。

表1 不同吸附載體的性能比較Tab.1 Comparison of property among three kinds of immobilization carriers

2.2 固定化細(xì)胞掃描電鏡觀測(cè)

通過(guò)掃描電鏡比較活性炭載體與活性炭固定化細(xì)胞后的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5可知，活性炭表面凹凸不平，存在縫隙和許多蜂窩形凹陷，這種孔隙結(jié)構(gòu)決定了活性炭具有良好的吸附性能。由圖5和圖6對(duì)比可知，活性炭表面附著著一層較厚的物質(zhì)，說(shuō)明在吸附培養(yǎng)過(guò)程中有細(xì)胞等物質(zhì)被吸附，借助于載體本身的孔隙、強(qiáng)度和韌性保證了固定化細(xì)胞的催化活性和效率[11]。

圖5 活性炭結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀測(cè)Fig.5 Observation of active carbon structure by scanning electron microscope

圖6 活性炭固定化細(xì)胞的掃描電鏡觀測(cè)Fig.6 Observation of cells immobilized on active carbon by scanning electron microscope

3 結(jié) 論

通過(guò)比較活性炭、硅膠G、大孔樹(shù)脂DM－130為載體吸附固定化發(fā)酵性絲孢酵母，發(fā)現(xiàn)40目活性炭作載體固定化發(fā)酵性絲孢酵母操作簡(jiǎn)單可行，安全性高，固定化效果較好。結(jié)果顯示，添加10g／L 40目活性炭于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、160r／min搖床培養(yǎng)48h時(shí)可吸附較多細(xì)胞，且細(xì)胞的脂肪酶活性較高。

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