劉長(zhǎng)建，劉 秋，姜 波，閆建芳，齊小輝

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605)

苯乳酸(PLA)又稱(chēng)3-苯基乳酸，或β-苯基乳酸即2-羥基-3-苯基丙酸。苯乳酸是繼乳酸菌產(chǎn)生的第一代抑菌物質(zhì)如乳酸、醋酸和第二代抑菌物質(zhì)如乳鏈菌素、片球菌素等細(xì)菌素以外的第三代天然抑菌物質(zhì)。能抑制有害微生物的生長(zhǎng)和發(fā)育，抑制有害微生物產(chǎn)生毒素，有效抵抗細(xì)菌和病毒的感染，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫力，保持機(jī)體健康狀態(tài)［1］。Dieuleveux發(fā)現(xiàn)，苯乳酸抑菌譜廣，對(duì)G+細(xì)菌、G-細(xì)菌和真核微生物均有抑制作用，這與Nisin等細(xì)菌素顯著不同。大部分細(xì)菌素只對(duì)與產(chǎn)生菌分類(lèi)學(xué)上相近的細(xì)菌有作用，如Nisin抑制許多除乳酸菌以外的G+細(xì)菌，但對(duì)絕大部分G-細(xì)菌和酵母菌、霉菌沒(méi)有作用［2］。乳酸菌的某些屬種具有合成苯乳酸的能力，國(guó)外專(zhuān)利及文獻(xiàn)中已報(bào)道從不同生物來(lái)源特別是發(fā)酵食品中分離得到合成苯乳酸的乳酸菌菌株，如Lactobacillus plantalum 等［1，3-4］。

本實(shí)驗(yàn)嘗試從發(fā)酵食品泡菜中分離出能產(chǎn)生苯乳酸的乳酸菌株，使其在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域發(fā)揮新的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵食品泡菜購(gòu)自大連市場(chǎng)。

1.2 儀器及試劑

主要儀器包括液相色譜儀(日本島津);UV-2450分光光度計(jì)(日本島津);DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏);TC-512基因擴(kuò)增儀(Techne)等。PCR反應(yīng)所用的相關(guān)試劑均購(gòu)于大連寶生物。其他試劑均為天津科密歐分析純產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

分離用培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基(Merck)和M17培養(yǎng)基(Oxoid)。

其他培養(yǎng)基:PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基和含6.5%，18%NaCl的 MRS 培養(yǎng)基［5］;含苯丙氨酸(PPA)的液體培養(yǎng)基。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的初步分離及純化

取1.0 g樣品加入9.0 mL無(wú)菌水室溫浸泡24 h。連續(xù)稀釋后取100 μL分別涂布于含碳酸鈣的2種分離固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落，轉(zhuǎn)接于對(duì)應(yīng)的分離培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，純化2次。篩選過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性、HPLC法檢測(cè)產(chǎn)乳酸［6］的菌株進(jìn)行下一步研究。

1.4.2 菌落形態(tài)、菌體細(xì)胞形態(tài)及生理生化特性

乳酸菌接種平板后，37℃恒溫培養(yǎng)，48 h后記錄菌落邊緣形狀、大小、顏色、與培養(yǎng)基的結(jié)合程度等菌落特征。同時(shí)高倍顯微觀察菌體革蘭氏染色、個(gè)體形狀、大小等細(xì)胞特征。分別測(cè)定菌株在10℃和45℃的生長(zhǎng)情況、運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性等生理生化特征［5］。

1.4.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將純化得到的菌種在37℃條件培養(yǎng)2 d后，離心收集菌體，提取細(xì)菌總DNA。采用通用引物對(duì)其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序后將序列輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，與基因庫(kù)內(nèi)所有核酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析［6］。

1.4.4 乳酸菌產(chǎn)苯乳酸試驗(yàn)

將菌株以2%的接種量分別接種于含0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%苯丙氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48 h。將菌株按2%的接種量接入含最適濃度苯丙氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中分別靜置培養(yǎng) 24，36，48，60，72 h。發(fā)酵液離心后取上清，0.2 μm的膜過(guò)濾，高效液相色譜測(cè)定苯乳酸的含量［1，6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選分離

根據(jù)菌落形態(tài)共篩選出12株疑似乳酸菌，轉(zhuǎn)接于對(duì)應(yīng)的分離培養(yǎng)基中，純化2次。篩選過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性、發(fā)酵產(chǎn)乳酸［6］的、生長(zhǎng)較好的2個(gè)菌株。

2.2 菌株的多相鑒定

2.2.1 菌落特征、細(xì)胞形態(tài)

2個(gè)菌株在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后菌落均為乳白色，邊緣光滑、圓整、粘稠，直徑在0.3～0.5 mm。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞短桿狀，細(xì)胞間呈短鏈或球狀排列(如圖1)。

圖1 菌株細(xì)胞形態(tài)的顯微觀察(×100)

2.2.2 耐鹽、耐溫特征

乳酸菌LMD在10℃和45℃均不生長(zhǎng)，而LRA2在10℃不能生長(zhǎng)，但能耐受 45℃;在6.5%NaCl時(shí)2個(gè)菌株都能生長(zhǎng)，而菌株LRA2在NaCl質(zhì)量體積達(dá)到18%時(shí)不能生長(zhǎng)(見(jiàn)表1)。

表1 菌株生長(zhǎng)特性

2.2.3 16S rDNA序列分析

以菌株LMD、LRA2總的DNA為模板，擴(kuò)增獲得了2條特異的擴(kuò)增條帶，長(zhǎng)度分別為1387 bp和1090 bp。將序列提交到GenBank獲得登錄號(hào)分別為KC108666和KC108667。通過(guò)Blast程序與GenBank核酸序列庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LMD和LRA2與多株腸膜明串珠菌的相似性都超過(guò)99%。明串珠菌屬共13個(gè)種［7］的eztaxon網(wǎng)站的16S rRNA序列，與菌株LMD和LRA2進(jìn)行聚類(lèi)分析(如圖2)，菌株 LMD和 LRA2與 Leuconostoc mesenteroides的3個(gè)亞種在同一分支上。因此可以確定菌株LMD和LRA2屬于明串珠菌屬中的腸膜明串珠菌(L.mesenteroides)。圖2中分支上的數(shù)值為自舉1 000次的結(jié)果，當(dāng)數(shù)值≥51%時(shí)顯示。

圖2 菌株LMD、LRA2和參比明串珠菌屬菌株的16S rDNA同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 乳酸菌產(chǎn)苯乳酸能力

乳酸菌LMD和LRA2皆能產(chǎn)苯乳酸，且產(chǎn)量隨著培養(yǎng)基中PPA質(zhì)量濃度上升而變大(如圖3)。當(dāng)培養(yǎng)基中PPA達(dá)到0.16%時(shí)，菌株的苯乳酸產(chǎn)量增加趨勢(shì)變緩;當(dāng)?shù)竭_(dá)0.2%時(shí)，菌株LMD苯乳酸產(chǎn)量達(dá)0.132 2 mg·mL-1，菌株LRA2 產(chǎn)量達(dá) 0.124 5 mg·mL-1。

圖3 培養(yǎng)基中苯丙氨酸含量對(duì)菌株產(chǎn)苯乳酸量的影響

當(dāng)培養(yǎng)基中含0.16%PPA時(shí)，菌株的苯乳酸產(chǎn)量隨時(shí)間增加而增加(如圖4)。前48 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸產(chǎn)量增加緩慢;而在48～60 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸產(chǎn)量增加趨勢(shì)最快。當(dāng)培養(yǎng)72 h時(shí)，菌株產(chǎn)苯乳酸含量最高，LMD和LRA2的苯乳酸產(chǎn)量分別達(dá)0.144 7 mg·mL-1和 0.158 5 mg·mL-1。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)苯乳酸量的影響

3 結(jié)論與討論

乳酸菌在自然界分布廣泛，實(shí)驗(yàn)從泡菜中初步分離得到過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性、發(fā)酵液產(chǎn)乳酸的乳酸菌12株，通過(guò)溫度、高鹽試驗(yàn)篩選到2株乳酸菌LMD和LRA2。根據(jù)菌落、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性以及16S rDNA序列比對(duì)，可鑒定LMD和LRA2為腸膜明串珠菌。采取在培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸的方法，利用HPLC法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的產(chǎn)量，菌株LMD和LRA2均能利用苯丙氨酸產(chǎn)苯乳酸。苯乳酸的產(chǎn)量與培養(yǎng)基中苯丙氨酸的添加量呈正相關(guān);當(dāng)苯丙氨酸的添加量為0.16%時(shí)，苯乳酸的產(chǎn)量與培養(yǎng)時(shí)間呈正比，在48～60 h產(chǎn)量增加最快;在72 h時(shí)，LMD的苯乳酸產(chǎn)量為0.144 7 mg·mL-1，LRA2的苯乳酸產(chǎn)量為0.158 5 mg·mL-1。

已經(jīng)有 Lactobacillus、Weissella、Enterococcus、Leuconostoc等多個(gè)屬的細(xì)菌能產(chǎn)苯乳酸的報(bào)道［1，3，4，8，9］，如李興峰［1］等分離的 112 株乳酸菌中有70株的苯乳酸產(chǎn)量在0.0166～0.0914 mg·mL-1。但目前明串珠菌屬的報(bào)道不多，只有Valerio［8］等從橄欖葉中分離的Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ITMY30能產(chǎn)生0.094 6 mg·mL-1苯乳酸，低于本研究分離的Leuconostoc mesenteroides LMD和LRA2的苯乳酸產(chǎn)量。本研究和其他研究表明，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代謝產(chǎn)物，個(gè)體差異大，其產(chǎn)量取決于菌株個(gè)體［1，8］。目前看來(lái)短期內(nèi)苯乳酸不能完全取代化學(xué)防腐劑和抗生素，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)觀點(diǎn)看，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)篩選出的高產(chǎn)苯乳酸菌株可作為菌株資源進(jìn)行深入的研究。

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