戈洋，汪靜，曲冰，潘超，古菲菲，鄒穎慧

(大連海洋大學(xué)理學(xué)院，遼寧大連116023)

納米顆粒因其具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸和宏觀量子隧道效應(yīng)的物理化學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，它在給人類帶來便利的同時(shí)也會(huì)對(duì)生物體構(gòu)成威脅。暴露于空氣中的納米顆粒對(duì)哺乳動(dòng)物生物效應(yīng)的相關(guān)報(bào)道屢見不鮮［1-6］。對(duì)細(xì)菌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ZnO、TiO2、Fe3O4和SiO2等納米顆粒會(huì)破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性，且粒徑越小毒性越強(qiáng)［7］。納米顆粒在應(yīng)用過程中也會(huì)進(jìn)入水體，劉婭琛等［8］研究發(fā)現(xiàn)，SiO2納米顆粒能夠降低小球藻的生物量和蛋白含量;董霞［9］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TiO2處理后的斑馬魚出現(xiàn)側(cè)游、體質(zhì)量減輕、比干重增加、鰓組織壞死或脫落等現(xiàn)象。但有關(guān)納米顆粒對(duì)金魚生物效應(yīng)的研究目前尚未見報(bào)道。同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，不同的同工酶與基因的關(guān)系不同［10］。生物在進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境的變化產(chǎn)生了與代謝活動(dòng)相統(tǒng)一的同工酶。乳酸脫氫酶 (LDH)廣泛存在于生物體的各器官組織中，是生物體代謝過程中不可或缺的一種酶。本研究中，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，分析不同濃度的納米顆粒對(duì)金魚LDH表達(dá)的影響，旨在為納米顆粒的安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用金魚Carassius auratus體長(zhǎng)為 (8.0±0.2)cm，購(gòu)自大連市香爐礁花鳥魚蟲市場(chǎng)。TiO2納米顆粒 (P25)購(gòu)自德國(guó)奧德賽公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及TiO2處理 將試驗(yàn)魚分為6組，每組5尾魚，分別用濃度為0(對(duì)照)、30、60、90、120、150 mg/L的TiO2溶液進(jìn)行24 h處理。

1.2.2 樣品的制備 低溫條件下對(duì)金魚進(jìn)行解剖，提取鰓、心、肝胰臟、腎和腦組織，用體積分?jǐn)?shù)為0.9%的預(yù)冷生理鹽水清洗各組織血污，加入pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，所加緩沖液的體積與金魚組織質(zhì)量之比為3∶1(mL∶g)，在4℃下以10 000 r/min離心30 min，取上清液，與體積分?jǐn)?shù)為75%的甘油等體積混合后，置于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 電泳 采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為5%，電極緩沖液為pH 8.8的Tris-Gly緩沖液。用DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀進(jìn)行電泳。用10 μL的微量進(jìn)樣器進(jìn)行上樣，每孔加入10 μL樣品，再加入適量的溴酚藍(lán)指示劑，連接電泳槽 (DYCZ-24D型垂直板電泳槽)的正負(fù)極，將電泳槽移至4℃的冰箱內(nèi)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間約為5 h。

1.2.4 染色及酶譜處理 電泳結(jié)束后，將凝膠置于LDH染色液中避光染色30 min后，用體積分?jǐn)?shù)為7%的醋酸進(jìn)行固定脫色。用數(shù)碼照相機(jī)拍照后使用Imagej軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TiO2對(duì)金魚各組織LDH同工酶譜的影響

從圖1可見:經(jīng)TiO2納米顆粒處理后，金魚鰓組織的酶帶發(fā)生了明顯變化，各濃度組鰓組織中LDH3缺失;對(duì)照組心臟組織中表達(dá)出4條酶帶，而各濃度組心臟中均缺失LDH4和LDH5;對(duì)照組肝胰臟中表達(dá)出5條酶帶，30、60、90、150 mg/L濃度組肝胰臟中LDH1、LDH3、LDH4和LDH5均消失，120 mg/L濃度組肝胰臟中LDH3和LDH5有表達(dá)且還表達(dá)出LDH6酶帶;對(duì)照組腎組織中表達(dá)出3條酶帶，而各濃度組缺失LDH3;對(duì)照組腦組織中表達(dá)出5條酶帶，而各濃度組缺失LDH4和LDH5。肝胰臟中LDH3和LDH5在低濃度組不表達(dá)，在120 mg/L濃度組中又出現(xiàn)，說明低濃度TiO2納米顆粒破壞了組織液中酶分子的構(gòu)象，當(dāng)濃度繼續(xù)升高，TiO2納米顆粒破壞細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞中的LDH滲透到組織液中繼而表達(dá)出酶活性。研究表明，經(jīng)TiO2納米顆粒處理后金魚各組織的LDH酶帶數(shù)減少。

圖1 TiO2納米顆粒對(duì)金魚各組織LDH同工酶譜的影響Fig.1 The effects of TiO2nanoparticles on LDH isozyme zymogram in different tissues

2.2 TiO2對(duì)金魚各組織LDH同工酶活性的影響

經(jīng)不同濃度的TiO2納米顆粒處理后，金魚鰓、心、肝胰臟、腎、腦組織中LDH同工酶的活性如表1所示。金魚鰓組織中，LDH1和LDH2活性隨TiO2濃度的升高而增強(qiáng)，TiO2濃度為120 mg/L時(shí)活性最強(qiáng)，超過120 mg/L時(shí)酶活性又呈下降趨勢(shì)，即低濃度誘導(dǎo)表達(dá)，高濃度抑制表達(dá);LDH3在對(duì)照組中活性較低，在各濃度組中均不表達(dá)，說明LDH有一定的環(huán)境耐受范圍，為適應(yīng)環(huán)境變化，LDH1和LDH2在環(huán)境脅迫下表現(xiàn)出應(yīng)激性，當(dāng)環(huán)境條件超過耐受范圍的閾值時(shí)，酶活性開始下降。LDH3的耐受范圍較LDH1、LDH2窄，低濃度的TiO2納米顆粒就可使其活性完全消失，說明LDH3對(duì)環(huán)境因子較敏感。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，金魚暴露于經(jīng)TiO2處理的曝氣水中時(shí)，鰓蓋扇動(dòng)頻率增加，對(duì)照組的鰓組織呈鮮紅色，30、60 mg/L濃度組的鰓組織顏色無明顯變化，但隨著TiO2濃度的升高 (如90、120 mg/L)，金魚鰓組織顏色逐漸加深，呈深紅色，各濃度組鰓組織中均能看到聚集的白色TiO2顆粒。當(dāng)TiO2濃度升高到150 mg/L時(shí)，鰓組織顏色趨于發(fā)白。

金魚心臟組織中，LDH1呈現(xiàn)低濃度誘導(dǎo)表達(dá)，高濃度抑制表達(dá);而LDH2則呈現(xiàn)低濃度抑制表達(dá)，高濃度誘導(dǎo)表達(dá);LDH4和LDH5在對(duì)照組中活性較LDH1和LDH2弱，在各濃度組中酶活性完全消失。LDH5只在對(duì)照組中出現(xiàn)且表達(dá)活性弱，這與心臟屬于好氧器官，催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸以產(chǎn)生大量的ATP來維持心臟的收縮功能有關(guān)。

金魚肝胰臟組織中，LDH1在各濃度組中活性完全消失;LDH2的活性隨TiO2濃度的升高而增強(qiáng);LDH3和LDH5表現(xiàn)為低濃度抑制表達(dá)，高濃度誘導(dǎo)表達(dá);LDH4在各濃度組中活性均消失;LDH6在對(duì)照組和低濃度組中均不表達(dá)，而在TiO2濃度為120 mg/L時(shí)出現(xiàn)了遷移率較低的LDH6酶帶，可能是外界環(huán)境的變化開啟了C基因的表達(dá)，這是生物受環(huán)境脅迫時(shí)基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。

金魚腎組織中，LDH1和LDH2在對(duì)照組中活性較強(qiáng)，在30、60、90 mg/L濃度組中活性穩(wěn)定，當(dāng)TiO2濃度升高至120 mg/L時(shí)酶活性明顯升高，到150 mg/L時(shí)活性略有下降，這與腎臟是排泄器官有關(guān);LDH3在對(duì)照組中活性低，但在各濃度組中活性完全消失，說明LDH3對(duì)環(huán)境因子較敏感。

表1 TiO2納米顆粒對(duì)金魚各組織LDH同工酶表達(dá)活性的影響Tab.1 The effects of TiO2nanoparticle on expression of LDH isozymes in different tissues in goldfish

金魚腦組織中，LDH1活性隨TiO2濃度的升高先增強(qiáng)后減弱;LDH2活性隨TiO2濃度的升高先減弱后增強(qiáng);LDH3活性在各濃度組略有降低;LDH4和LDH5在對(duì)照組中活性較弱，各濃度組中活性均消失。

綜上所述，TiO2納米顆粒對(duì)金魚組織LDH有毒性作用，一方面納米顆粒會(huì)使LDH酶帶數(shù)減少，另一方面納米顆粒會(huì)進(jìn)入細(xì)胞使細(xì)胞膜的通透性改變從而影響細(xì)胞中LDH的活性，同時(shí)在肝胰臟中為協(xié)調(diào)環(huán)境的變化出現(xiàn)C基因的選擇性表達(dá)。

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