張瑞濤，任 芳，史惠蓉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450052

·論 著·

不同期別卵巢上皮性癌組織中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1表達(dá)

張瑞濤，任 芳，史惠蓉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450052

目的研究結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)在不同期別卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系。方法選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2008年5月至2010年8月住院的卵巢上皮性癌患者52例，采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)這些患者原發(fā)病灶組織樣本中的MACC1 mRNA和蛋白表達(dá)，比較不同臨床分期患者組織中的MACC1表達(dá)水平，采用Kaplan-Meier法分析MACC1表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果MACC1 mRNA在Ⅰ～Ⅳ期卵巢癌樣本中的相對(duì)表達(dá)量分別為0．72 ±0．01、0．75 ±0．01、0．78 ±0．01 和0．81 ±0．02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51．305，P=0．000);MACC1 蛋白在Ⅰ ～Ⅳ期卵巢癌樣本中的相對(duì)表達(dá)量分別為0．71 ±0．04、0．73 ±0．02、0．76 ±0．01 和0．84 ±0．05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=65．142，P=0．000)。截至2012年12月隨訪結(jié)束，Ⅲ～Ⅳ期中復(fù)發(fā)及死亡患者組織樣本中MACC1蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于病情穩(wěn)定患者 (0．85±0．03比0．74±0．05，F(xiàn)=72．324，P=0．000)。相對(duì)于 MACC1表達(dá)較低的Ⅰ～Ⅱ期患者，MACC1表達(dá)較高的Ⅲ～Ⅳ期患者的生存時(shí)間明顯縮短 (χ2=29．804，P=0．000)。結(jié)論

MACC1表達(dá)增加可能提示卵巢上皮性癌患者預(yù)后不良，MACC1可作為晚期卵巢上皮性癌的標(biāo)志物。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1;卵巢上皮性癌;臨床分期;預(yù)后

Acta Acad Med Sin，2014，36(1)：47-51

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)是新發(fā)現(xiàn)的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物，可用于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷［1-2］。目前研究顯示，MACC1基因與胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有作為惡性腫瘤臨床治療靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)的潛在價(jià)值［3-4］。本課題組前期研究顯示，卵巢上皮性癌組織中存在MACC1異常高表達(dá)，可能與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［5］。本研究分析了MACC1在不同期別卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為研究MACC1與卵巢癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

材料和方法

組織標(biāo)本和臨床資料鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2008年5月至2010年8月住院的初診卵巢上皮性癌患者52例，手術(shù)切除原發(fā)病灶組織樣本?；颊吣挲g21～75歲，中位年齡53歲;組織學(xué)分級(jí)：G1級(jí)10例，G2級(jí)14例，G3級(jí)28例;臨床分期［6］：Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期24例，Ⅳ期12例 (其中腹壁皮下脂肪轉(zhuǎn)移灶3例，術(shù)中探查為腹膜后非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶4例，肝實(shí)質(zhì)微小占位、術(shù)后病變擴(kuò)大穿刺活檢病理證實(shí)為轉(zhuǎn)移5例);組織學(xué)類(lèi)型：漿液性癌30例，黏液性癌22例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例 (其中僅盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例，僅腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者4例，兩處淋巴結(jié)均存在轉(zhuǎn)移者5例)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例。所有組織樣本的收集和用途均獲得患者知情同意，并經(jīng)鄭州大學(xué)道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。入選患者術(shù)后均接受規(guī)范化療 (紫杉醇類(lèi)聯(lián)合鉑類(lèi))，耐藥的復(fù)發(fā)患者采用二線化療藥物聯(lián)合化療。

主要試劑Trizol為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，RevertAid first strand cDNA合成試劑盒為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品，2×Taq Master Mix為上海萊楓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Western及IP蛋白裂解液、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自江蘇碧云天生物公司，兔抗人MACC1多克隆抗體為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒、兔抗人βactin單克隆抗體、鼠抗兔單克隆IgG均購(gòu)自北京中杉金橋科技有限公司。

RT-PCR采用Trizol提取組織總RNA，參照RevertAid first strand cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。RT-PCR所用引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板 1 μl、2 × Taq Master Mix 11 μl、正向引物1 μl、反向引物 1 μl、去 RNA 酶水 11 μl。反應(yīng)條件為：94℃ 3 min;94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃終止。應(yīng)用Image-Pro Plus 6．0軟件分析特異性目的條帶的灰度值，將β-actin設(shè)為內(nèi)參對(duì)照。

表1 RT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

Western blot法 采用Western及IP蛋白裂解液提取組織樣本總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。分別取30 μg總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，恒壓20V半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉2 h，分別用 MACC1抗體 (1∶75)、β-actin抗體(1∶500)4℃孵育過(guò)夜，IgG(1∶2000) 室溫孵育2 h。ECL試劑盒顯色后曝光，采用Image Pro-Plus 6．0軟件分析特異性目的條帶的灰度值，將β-actin設(shè)為內(nèi)參對(duì)照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同期別卵巢上皮性癌組織中MACC1表達(dá)的差異比較采用單因素方差分析和Bonferroni分析，采用Kaplan-Meier法分析MACC1表達(dá)與卵巢上皮性癌患者預(yù)后的關(guān)系，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

MACC1 mRNA在不同期別卵巢癌組織中的表達(dá)MACC1 mRNA在Ⅰ～Ⅳ期卵巢上皮性癌組織樣本中的相對(duì)表達(dá)量分別為0．72 ±0．01、0．75 ±0．01、0．78 ±0．01 和0．81 ±0．02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=51．305，P=0．000)，臨床分期越晚，MACC1 mRNA表達(dá)越高(圖1)。

MACC1蛋白在不同期別卵巢癌組織中的表達(dá)MACC1蛋白在Ⅰ～Ⅳ期卵巢上皮性癌組織樣本中的相對(duì)表達(dá)量分別為0．71 ±0．04、0．73 ±0．02、0．76 ±0．01 和0．84 ±0．05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=65．142，P=0．000)，臨床分期越晚，MACC1蛋白表達(dá)越高 (圖2)。

圖1 MACC1 mRNA在不同期別卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)Fig 1 Expressions of MACC1 mRNA in different stages of epithelial ovarian cancer

圖2 MACC1蛋白在不同期別卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)Fig 2 Expressions of MACC1 protein in different stages of epithelial ovarian cancer

MACC1蛋白表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系截至2012年12月，入組患者隨訪時(shí)間為11～55個(gè)月，中位隨訪時(shí)間29個(gè)月，隨訪結(jié)束時(shí)45例存活，7例死亡 (表2)。

截至隨訪結(jié)束，早期 (Ⅰ～Ⅱ期)患者中復(fù)發(fā)患者組織樣本中MACC1的蛋白表達(dá)量高于病情穩(wěn)定患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (0．73 ± 0．04 比 0．72 ±0．01，F(xiàn)=371．844，P=0．179);晚期 (Ⅲ～Ⅳ期) 患者中復(fù)發(fā)及死亡患者組織樣本中的MACC1蛋白表達(dá)量顯著高于病情穩(wěn)定患者 (0．85 ±0．03 比 0．74 ±0．05，F(xiàn)=72．324，P=0．000)。晚期患者組織樣本中的MACC1蛋白表達(dá)量高于早期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (0．81±0．02比0．72 ±0．05，F(xiàn)=58．365，P=0．000)。與 MACC1 表達(dá)較低的早期患者比較，MACC1表達(dá)較高的晚期患者的生存時(shí)間明顯縮短 ( χ2=29．804，P=0．000，圖3)。

表2 52例卵巢上皮性癌患者術(shù)后隨訪情況Table 2 Follow-up information of 52 epithelial ovarian cancer patients after surgery

圖3 MACC1蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 3 Relationship between the expression of MACC1 protein and the prognosis of epithelial ovarian cancer patients

討 論

近年來(lái)，隨著手術(shù)和化療水平的提高，卵巢癌的死亡率有所下降，早期患者的5年生存率為90%，但70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)病情已至晚期而得不到有效治療，而晚期患者的5年生存率甚至不足30%，目前其死亡率位居各類(lèi)婦科惡性腫瘤之首［7］。卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制目前仍不清楚，因此探索卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，明確其分子生物學(xué)行為，探尋新的、有效的卵巢癌分子生物學(xué)診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)標(biāo)志物，是當(dāng)前卵巢癌臨床治療和研究中亟待解決的嚴(yán)峻課題。

Stein等［1］采用全基因組表達(dá)分析技術(shù)首次在結(jié)腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)了MACC1，其表達(dá)水平是預(yù)測(cè)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移形成和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期的獨(dú)立影響因素。MACC1可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte growth factor，HGF)誘導(dǎo)的播散，以及小鼠模型中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而MACC1突變的癌細(xì)胞 (SH3結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列缺失)則無(wú)以上表現(xiàn)［1］。存在轉(zhuǎn)移灶的結(jié)腸癌患者的組織樣本中MACC1的表達(dá)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移灶的患者;MACC1 mRNA表達(dá)水平較低的結(jié)腸癌患者5年生存率為80%，而表達(dá)水平較高的患者5年生存率僅為15%;MACC1預(yù)測(cè)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移陽(yáng)性和陰性的準(zhǔn)確性分別為74%和80%，可作為判斷結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物［8］。近來(lái)有研究顯示MACC1與肺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，可用于相應(yīng)惡性腫瘤的預(yù)后判斷和分析［9-11］。

侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢上皮性癌最重要的惡性生物學(xué)特點(diǎn)，臨床分期越晚，病變侵犯的部位越廣泛，臨床治療效果越不理想，患者的預(yù)后越差。本課題的前期免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，卵巢上皮性癌組織中存在MACC1異常高表達(dá)，其陽(yáng)性率顯著高于正常卵巢組織和良性卵巢上皮性腫瘤組織，且臨床分期越晚、組織分化越差和伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中MACC1的陽(yáng)性率越高，提示MACC1的異常表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。本研究中RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在不同期別的卵巢上皮性癌原發(fā)病灶組織樣本中，患者的臨床分期越晚，MACC1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平越高，晚期 (Ⅲ～Ⅳ期)患者組織樣本中MACC1的表達(dá)水平顯著高于早期 (Ⅰ～Ⅱ期)患者，而晚期患者中復(fù)發(fā)和死亡患者組織樣本中的MACC1表達(dá)水平明顯高于病情穩(wěn)定患者。此外，與MACC1表達(dá)較低的Ⅰ～Ⅱ期患者比較，MACC1表達(dá)較高的Ⅲ～Ⅳ期患者的生存時(shí)間明顯縮短。上述結(jié)果表明，MACC1表達(dá)增加可能提示卵巢上皮性癌患者預(yù)后不良，可作為晚期卵巢上皮性癌的標(biāo)志物。

綜上，MACC1異常表達(dá)可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)增加可能提示卵巢上皮性癌患者預(yù)后不良，可作為晚期卵巢上皮性癌的標(biāo)志物。進(jìn)一步研究MACC1異常表達(dá)與卵巢癌的關(guān)系，有助于闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為卵巢癌的臨床治療和預(yù)后評(píng)估提供新的方法。

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Expression of Metastasis-associated in Colon Cancer-1 in Different Stages of Epithelial Ovarian Cancer

ZHANG Rui-tao，REN Fang，SHI Hui-rong

Department of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

SHI Hui-rong Tel：0371-67967072，E-mail：huirongshizzu@yahoo．com

ObjectiveTo investigate the expression of metastasis-associated in colon cancer-1(MACC1)in different International Federation of Gynecology and Obstetrics(FIGO)stages of epithelial ovarian cancer and its relationship with prognosis．MethodsBetween May 2008 and August 2010，52 epithelial ovarian cancer patients were selected from the Department of Obstetrics and Gynecology of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University．Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blotting were used to detect the expression of MACC1 mRNA and protein in the primary lesions of epithelial ovarian cancer patients，the levels of MACC1 in different stage patients were compared，and the relationship between expression of MACC1 and prognosis of ovarian cancer patients was analyzed by Kaplan-Meier analysis．ResultsThe relative expression levels of MACC1 mRNA in epithelial ovarian cancer fromⅠstage toⅣ stage were 0．72 ±0．01，0．75 ±0．01，0．78 ±0．01，and 0．81 ±0．02，respectively(F=51．305，P=0．000) ．The expression levels of MACC1 protein from Ⅰ stage to Ⅳ stage were0．71 ±0．04，0．73 ±0．02，0．76 ±0．01，and 0．84 ±0．05，respectively(F=65．142，P=0．000) ．At the end of the follow-up，the expression of MACC1 protein in recurrence and dead patients ofⅢ-Ⅳ stages was obviously higher than that in the patients with stable disease(0．85 ± 0．03 vs．0．74 ± 0．05，F(xiàn)=72．324，P=0．000)．Compared toⅠ-Ⅱstage patients with lower MACC1 expression，the survival time ofⅢ-Ⅳ stage patients with higher MACCC1 expression was significantly shorter( χ2=29．804，P=0．000)．Conclusions Increased expression of MACC1 may indicate poor prognosis of ovarian cancer patients．Therefore，MACC1 may be a potential biomarker for advanced ovarian cancer．

metastasis-associated in colon cancer-1;epithelial ovarian cancer;clinical stage;prognosis

史惠蓉 電話：0371-67967072，電子郵件：huirongshizzu@yahoo．com

R737．31

A

1000-503X(2014)01-0047-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．01．009

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 (122102310545)Supported by the Key Scientific and Technological Project of Henan Province(122102310545)

2013-05-17)