孫 穎，丁 煥，黎曉晴，黎 莉

1山東大學 齊魯醫(yī)院腫瘤中心化療科，濟南 250012

2浙江大學醫(yī)學院，杭州 310058

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑AG014699聯(lián)合化療對三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的影響

孫 穎1，丁 煥1，黎曉晴2，黎 莉1

1山東大學 齊魯醫(yī)院腫瘤中心化療科，濟南 250012

2浙江大學醫(yī)學院，杭州 310058

目的研究多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (PARP)抑制劑AG014699聯(lián)合多西他賽 (DTX)或卡鉑 (CBP)對三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的影響，探討PARP抑制劑AG014699聯(lián)合化療是否有協(xié)同抗腫瘤效應。方法PARP抑制劑AG014699與DTX、CBP單獨或聯(lián)合作用于MDA-MB-231細胞，細胞增殖及細胞毒性實驗法檢測細胞增殖并用聯(lián)合用藥公式分析合用效應 (q值0．85～1．15為單純相加，＞1．15為協(xié)同，＜0．85為拮抗);流式細胞儀分析細胞凋亡及周期分布。結果PARP抑制劑AG014699、DTX、CBP單獨作用于MDA-MB-231細胞，均可抑制增殖，誘導凋亡，引起細胞周期阻滯;PARP抑制劑AG014699(10 μmol/L) 與DTX(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)、CBP(10-5、10-4mol/L) 聯(lián)合作用時，q值在0．85～1．15，顯示相加效應;PARP抑制劑AG014699與CBP(10-3mol/L)聯(lián)合作用時，q值＞1．15，顯示協(xié)同效應。PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX或CBP能進一步促進凋亡，并使G2/M期細胞比例增加。結論PARP抑制劑AG014699聯(lián)合化療藥物DTX或CBP能顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖，發(fā)揮相加或協(xié)同抗腫瘤作用。

三陰性乳腺癌;多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶;多西他賽;卡鉑

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：135-139

三陰性乳腺癌具有惡性程度高、進展快、侵襲性強、復發(fā)和轉移率高等特點［1-3］。由于其缺乏針對雌、孕激素受體的內(nèi)分泌治療及針對人表皮生長因子受體-2的靶向治療，尋找新的治療靶點成為三陰性乳腺癌研究的熱點。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 ［poly(ADP-ribose)polymerases，PARP］抑制劑是DNA復制、損傷修復、細胞增殖分化調(diào)控等過程中的關鍵酶［4-6］，尤其PARP-1在DNA單鏈損傷修復中發(fā)揮重要作用。根據(jù)“合成致死”理論，PARP抑制劑對伴有人類乳腺癌易感基因突變導致存在DNA雙鏈損傷修復缺陷的三陰性乳腺癌可能發(fā)揮治療作用［7-9］。鉑類藥物通過與腫瘤細胞DNA結合形成Pt-DNA復合物導致DNA鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)，DNA復制障礙，從而抑制腫瘤細胞分裂［10］。理論上與影響DNA損傷的藥物PARP抑制劑聯(lián)合應該顯示協(xié)同抗腫瘤作用。多西他賽是作用于有絲分裂期 (M期)的周期特異性化療藥物，多項臨床研究已證實以多西他賽為基礎的化療能顯著延長三陰性乳腺癌患者的總生存期［11］。本研究旨在觀察PARP抑制劑AG014699聯(lián)合多西他賽 (docetaxel，DTX)或卡鉑(carboplatin，CBP)能否進一步抑制三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的增殖，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，以探討PARP抑制劑聯(lián)合化療在三陰性乳腺癌治療中的價值。

材料和方法

材料三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231由生物化學與分子生物學研究所提供;PARP抑制劑AG014699、DTX、CBP均購自Sigma公司;PARP抑制劑AG014699用二甲基亞砜配制成10-3mol/L儲存液，二甲基亞砜終濃度 ＜0．1%;DTX、CBP用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)分別配制成10-3mol/L、10-2mol/L儲存液;1640培養(yǎng)基、胰酶含EDTA購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司;細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒 (cell counting kit，CCK)-8及周期分布凋亡試劑盒購自碧云天公司。

細胞培養(yǎng)三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。細胞貼壁生長，每2～3天傳代1次。

CCK-8實驗檢測細胞增殖檢測PARP抑制劑AG014699(0．1、1、10、20、40 μmol/L)、DTX(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)、CBP(10-6、10-5、10-4、10-3mol/L)3種藥物對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用。將接近半數(shù)抑制濃度 (inhibitory concentration 50，IC50)的PARP抑制劑AG014699，分別與各濃度 DTX(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)或CBP(10-6、10-5、10-4、10-3mol/L) 聯(lián)合作用于MDA-MB-231細胞。觀察PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX或CBP對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用。

取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按7×103/孔接種于96孔板，隔夜細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，替換為PARP抑制劑AG014699、DTX、CBP各濃度單藥以及PARP抑制劑AG014699與不同濃度的DTX或CBP聯(lián)合，作為實驗組;常規(guī)加培養(yǎng)基1640作為對照組，培養(yǎng)24 h。PBS洗滌，加100 μl含10%CCK-8培養(yǎng)基，作用1 h后，酶標儀測各孔光密度值 (optical density，OD)。公式：細胞活力 (%)= ［(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)］ ×100%;抑制率 (%) =(1-細胞活力) ×100%;聯(lián)合用藥效果根據(jù)金氏公式［12］判斷：q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中E(a+b)為聯(lián)合抑制率，Ea和Eb分別為A藥和B藥單用的抑制率。q值0．85～1．15為單純相加，＞1．15為協(xié)同，＜0．85為拮抗。

流式細胞術檢測凋亡、周期分布根據(jù)CCK-8實驗結果，PARP抑制劑AG014699、DTX、CBP均選取接近IC50濃度用于流式檢測。觀察PARP抑制劑AG014699、DTX、CBP單藥以及PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX或CBP對MDA-MB-231細胞凋亡及周期分布的影響。將MDA-MB-231細胞以105/孔接種于6孔板，隔夜細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，替換為PARP抑制劑 AG014699、DTX、CBP單藥以及 PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX或CBP，每組設3個復孔，作用24 h后收獲細胞。凋亡檢測：4℃預冷的PBS洗細胞2次，按照異硫氰酸熒光素細胞凋亡試劑盒說明書測定細胞凋亡。周期分布檢測：與細胞凋亡檢測同樣方法收集PBS洗滌后細胞，加預冷70%乙醇固定，4℃過夜。加碘化丙啶，37℃避光30 min，上機檢測細胞周期分布。

統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩兩比較進行獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

PARP抑制劑 AG014699、DTX、CBP對 MDAMB-231細胞增殖的影響PARP抑制劑AG014699(0．1、1、10、20、40 μmol/L) 作用 24 h，MDA-MB-231細胞活力分別為 (94．83 ±3．93)%、(79．42 ±5．52)%、 (63．75 ± 4．34)%、 (38．97 ± 8．42)%、(29．70±3．35)%，PARP抑制劑AG014699與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義 (P均＜0．05)(圖1)。IC50=(17．77 ± 3．72) μmol/L。其中 0．1、1、10 μmol/L均小于IC50，將10 μmol/L作為與DTX、CBP聯(lián)合的PARP抑制劑AG014699藥物濃度。

DTX(10-9mol/L)單藥或DTX(10-9mol/L)聯(lián)合PARP抑制劑 AG014699(10 μmol/L) 作用 24 h，MDA-MB-231 細胞活力分別為 (81．24 ± 11．91)% 和(69．77±17．94)%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)，q 值 ＜0．85，無拮抗和促進效應;DTX(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L) 作用24 h，MDA-MB-231細胞活力分別為 (85．74±3．10)%、 (72．74±4．66)%、(55．18 ±3．19)%、(45．95 ±3．82)%，與 PARP 抑制劑AG014699(10 μmol/L) 聯(lián)合作用 24 h，MDA-MB-231細胞活力分別為 (58．34 ±2．59)%、(52．81 ±2．01)%、(41．23 ±3．38)%、(24．82 ±0．73)%，聯(lián)合后細胞活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義 (P均＜0．05)，q值均在0．85～1．15，顯示相加效應 (圖2)。DTX 10-6mol/L濃度最接近 IC50= (4．82 ±0．03) ×10-6mol/L，將10-6mol/L DTX用于凋亡周期分布檢測。

CBP(10-6mol/L)單藥或CBP(10-6mol/L)聯(lián)合PARP抑制劑 AG014699(10 μmol/L) 作用24 h，MDA-MB-231細胞活力分別為 (90．00±6．18)%和(78．33±2．89)%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)，q 值 ＜0．85，無拮抗和促進效應;CBP(10-5、10-4mol/L)作用24 h，MDA-MB-231細胞活力分別為(87．87 ±2．30)%、(76．82 ±3．37)%，與 PARP 抑制劑 AG014699(10 μmol/L) 聯(lián)合作用24 h，MDAMB-231細胞活力分別為 (60．44 ±1．95)%、(50．55 ±3．07)%，聯(lián)合后細胞活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義 (P均＜0．05)，q值均在0．85～1．15，顯示相加效應;CBP(10-3mol/L)單藥或CBP(10-3mol/L)聯(lián)合PARP抑制劑AG014699(10 μmol/L) 作用24 h，MDA-MB-231細胞活力分別為 (40．71±1．68)%和(12．07±1．63)%，聯(lián)合后細胞活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05)，q值＞1．15，顯示協(xié)同效應 (圖3)。CBP 10-4mol/L濃度最接近 IC50=(4．92±0．37) ×10-4mol/L，將10-4mol/L CBP 用于凋亡周期分布檢測。

PARP抑制劑 AG014699、DTX、CBP對 MDAMB-231細胞周期分布的影響PARP抑制劑AG014699(1、10、20、40 μmol/L) 作用MDA-MB-231細胞24 h，G2/M期細胞比例分別為 (60．35±2．23)%、(65．46±2．24)%、(69．45 ±2．07)%、(82．71 ±2．39)%，與對照組二甲基亞砜 (21．44±2．14)%比較，G2/M期細胞比例增加，差異具有統(tǒng)計學意義 (P均＜0．05)(圖4)。

圖1 PARP抑制劑AG014699對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig 1 Anti-tumor effects of PARP inhibitor AG014699 on MDA-MB-231 cells

圖2 DTX單藥或DTX聯(lián)合PARP抑制劑AG014699對MDAMB-231細胞增殖的影響Fig 2 Anti-tumor effects of DTX alone or combined with PARP inhibitor AG014699 on MDA-MB-231 cells

圖3 CBP單藥或CBP聯(lián)合PARP抑制劑AG014699對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig 3 Anti-tumor effects of CBP alone or combined with PARP inhibitor AG014699 on MDA-MB-231 cells

圖4 PARP抑制劑AG014699對MDA-MB-231細胞周期分布的影響Fig 4 The effect of PARP inhibitors AG014699 on cell cycle distribution

DTX(10-6mol/L)作用MDA-MB-231細胞24 h，G2/M期細胞比例為 (50．93±4．22)%，聯(lián)合 PARP抑制劑AG014699(10 μmol/L)后，G2/M期細胞比例為 (62．69±3．30)%，與 DTX(10-6mol/L) 單藥比較，聯(lián)合后G2/M期細胞比例進一步增加，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05)。

CBP(10-4mol/L)作用MDA-MB-231細胞24 h，G0/G1期、G2/M期細胞比例分別為 (78．85±4．21)%、(10．49 ±3．22)%; 聯(lián)合 PARP 抑制劑 AG014699(10 μmol/L)后，G0/G1期、G2/M期細胞比例分別為 (43．37 ±4．37)%、 (41．19 ±5．16)%，G0/G1 期細胞比例減少，G2/M期細胞比例增加，差異具有統(tǒng)計學意義 (P均＜0．05)。

PARP抑制劑 AG014699聯(lián)合 DTX或 CBP對MDA-MB-231細胞凋亡的影響DTX(10-6mol/L)單藥或DTX(10-6mol/L)聯(lián)合PARP抑制劑AG014699(10 μmol/L)，MDA-MB-231細胞凋亡率分別為 (19．78±3．22)%、(36．57±1．35)%，聯(lián)合后細胞凋亡率提高，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05);CBP(10-4mol/L)單藥或CBP(10-4mol/L)聯(lián)合PARP抑制劑AG014699(10 μmol/L)，MDA-MB-231細胞凋亡率分別為(14．89 ±1．67)%、(32．97 ±2．20)%，聯(lián)合后細胞凋亡率提高，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05)。

討 論

針對單一靶點的抗腫瘤治療常療效有限且容易產(chǎn)生耐藥，不同作用機制的聯(lián)合治療有望獲得更佳療效［13］。鉑類藥物作用機制主要是與DNA上的鳥嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶結合形成Pt-DNA加合物，導致DNA的鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián)，引起DNA損傷，從而導致細胞死亡。有報道鑒于PARP抑制劑是通過影響DNA損傷修復發(fā)揮抗腫瘤作用，其與影響DNA化學結構的藥物 (如鉑類、蒽環(huán)類)聯(lián)合，應該發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用［14-15］。本研究顯示 PARP抑制劑 AG014699聯(lián)合CBP，能明顯抑制MDA-MB-231細胞增殖，產(chǎn)生單純相加或協(xié)同效應，并進一步促進細胞凋亡，這與Hay等［16］研究結果一致。此外，本研究 PARP抑制劑AG014699與CBP的聯(lián)合抑制增殖作用與CBP的濃度相關，當CBP濃度較低時，不顯示聯(lián)合功效，隨著CBP濃度的增加，顯示相加或協(xié)同功效，提示聯(lián)合用藥時需考慮化療藥物的濃度。

多西他賽屬紫杉醇類藥物，通過實質上“凍結”細胞內(nèi)在骨架，抑制腫瘤細胞分化，最終導致細胞死亡［17-18］。本研究將PARP抑制劑AG014699與非DNA損傷藥物DTX聯(lián)合，MDA-MB-231細胞增殖受到明顯抑制，產(chǎn)生相加效應，同時可以進一步促進凋亡，使細胞阻滯于G2/M期，這提示PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX有可能是治療三陰性乳腺癌的有效措施。PARP抑制劑AG014699與DTX聯(lián)合產(chǎn)生相加效應的機制可能與多西他賽可以降低胞內(nèi)依賴于周期蛋白的激酶 (細胞周期蛋白依賴性激酶1)，而細胞周期蛋白依賴性激酶1在一定程度上又可以提高PARP抑制劑AG014699對細胞的殺傷作用。針對PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX的良好抗腫瘤作用機制有待進一步研究。

綜上，PARP抑制劑AG014699聯(lián)合DTX或CBP能明顯抑制三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的增殖，促進凋亡，發(fā)揮相加或協(xié)同抗腫瘤作用，為提高三陰性乳腺癌的聯(lián)合治療效果提供了新的思路。

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Effects of Poly(ADP-ribose)Polymerase Inhibitor AG014699 Combined with Chemotherapy on the Proliferation of Triple-negative Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231

SUN Ying1，DING Huan1，LI Xiao-qing2，LI Li1

1Department of Clinical Oncology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China
2Medical College，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China

LI Li Tel：0531-82169851，E-mail：drlili5060@163．com

ObjectiveTo observe the effects of poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitor AG014699 alone and combined with docetaxel(DTX)or carboplatin(CBP)on the proliferation of triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 and to investigate whether PARP inhibitor AG014699 combined with chemotherapy could play a synergistic antitumor effect．MethodsMDA-MB-231 cells were treated by PARP inhibitor AG014699 alone or combination with DTX or CBP．Cell proliferation was measured by cell counting kit-8 assay．The combined effect was evaluated by q value less than 0．85，in the range of 0．85 and 1．15，more than 1．15，which respectively meant that the combined effect of the drugs was antagonistic，additive，and synergistic．Results Treatment with PARP inhibitor AG014699，DTX，or CBP alone inhibited the proliferation，induced apoptosis and blocked the cell cycle．The cell viability of AG014699(10 μmol/L)combined with DTX(10-8，10-7，10-6，10-5mol/L)or CBP(10-5，10-4mol/L)were lower than that of the drug used alone，and q value was between 0．85 and 1．15，suggesting the combined effect was additive．The cell viability of AG014699(10 μmol/L)combined with CBP(10-3mol/L)was lower than that of the drug used alone，and q value was more than 1．15，suggesting the combined effect was synergetic．A combination of PARP inhibitor AG014699 and DTX or CBP promoted apoptosis and increased the proportion of G2/M stage cells．Conclusion PARP inhibitor AG014699 combined with DTX or CBP can remarkably inhibit MDA-MB-231 cell proliferation，showing additive or synergistic antitumor effects．

triple-negative breast cancer;poly(ADP-ribose)polymerase;docetaxel;carboplatin

黎 莉 電話：0531-82169851，電子郵件：drlili5060@163．com

R730．53

A

1000-503X(2014)02-0135-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．004

山東省科技發(fā)展計劃 (2013GSF11839)Supported by the Shandong Province Sciences and Technology Development Projects(2013GSF11839)

2014-01-17)

·論 著·