袁曉玲,王景方,任鴻雁,董子峰△,孔輝

(1.聊城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;2.聊城市東昌府區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210029)

地塞米松聯(lián)合淀粉樣β蛋白對大鼠海馬組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究

袁曉玲1,王景方2,任鴻雁1,董子峰1△,孔輝3

(1.聊城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;2.聊城市東昌府區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210029)

目的 探討地塞米松（dexamethasone，DEX)聯(lián)合淀粉樣β蛋白（amyloidβ-protein，Aβ)對大鼠海馬組織的損傷機(jī)制。方法 采用水迷宮方法檢測DEX聯(lián)合淀粉樣β蛋白對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響；采用MTT方法檢測DEX聯(lián)合Aβ蛋白對大鼠海馬神經(jīng)元活力的影響作用；采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測DEX聯(lián)合Aβ蛋白對大鼠海馬神經(jīng)元中DNA的損傷程度。結(jié)果 與GC維持+DEX1組比較，GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。與GC維持+DEX5組比較，GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長，具有顯著性差異（P＜0.01)，第9、10天的游泳距離延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；與GC維持+Aβ組比較，GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。與GC維持+Aβ組比較，GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長，具有顯著性差異（P＜0.01)，并且第10天游泳距離延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；與溶劑對照組比較，各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時(shí)，均會(huì)使海馬神經(jīng)元的活力下降，且差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；DEX10+Aβ5組分別與DEX10組和Aβ5組比較，均有較嚴(yán)重彗星拖尾現(xiàn)象，且均具有顯著性差異（P＜0.01)。結(jié)論 DEX與Aβ合用比單用DEX或Aβ對大鼠學(xué)習(xí)記憶力下降影響較大；DEX與Aβ合用從細(xì)胞水平上會(huì)降低海馬神經(jīng)元的活力，單用任何一種均無影響；DEX與Aβ合用會(huì)造成海馬神經(jīng)元中DNA損傷.

DEX；淀粉樣β蛋白；聯(lián)合作用；大鼠；海馬組織

阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)是一種起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展、發(fā)病率高、危害極大的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。Spagnol G等［1］研究表明細(xì)胞凋亡可以降低阿爾茨海默病病人腦組織中神經(jīng)元的數(shù)量。有研究［2-3］表明AD的發(fā)病機(jī)制可能與神經(jīng)元被淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)凋亡有關(guān)聯(lián)。AD主要的病理學(xué)特征是在細(xì)胞內(nèi)有神經(jīng)元纖維纏結(jié)出現(xiàn)并且在神經(jīng)元外有老年斑的沉積,老年斑的主要成分是淀粉樣β蛋白(amyloid beta protein,Aβ)。Aβ主要通過干擾鈣平衡和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)等引起神經(jīng)元異常,在AD的發(fā)病和發(fā)展中起重要作用［4］。20世紀(jì)90年代初有人發(fā)現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamic-pituitary-adrenocortical,HPA)軸功能失調(diào)與AD有關(guān)。然而,海馬神經(jīng)元中含有大量機(jī)體正常分泌的糖皮質(zhì)激素(glueocortieoids,GC)受體。GC不僅可以穿過血腦屏障發(fā)揮生理和藥理作用,而且可以促進(jìn)氧自由基神經(jīng)元的毒性。AD患者主要表現(xiàn)為循環(huán)中的基礎(chǔ)糖皮質(zhì)激素水平顯著升高及HPA軸的功能失調(diào)［5］,目前出現(xiàn)這一現(xiàn)象的根本作用機(jī)制國內(nèi)外少有報(bào)道,因此,本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分子水平實(shí)驗(yàn)探討AD發(fā)病機(jī)制,觀察DEX和Aβ聯(lián)合作用對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取清潔級SD大鼠68只,動(dòng)物許可證號:SCXK(蒙)2002-0001,購自蒙古大學(xué)動(dòng)物中心,體質(zhì)量200～250 g,給予正常飼料喂養(yǎng),雌雄皆可(其中8只為已懷孕18d,用于體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元)。

1.1.2 主要試劑及儀器

Aβ蛋白:Sigma公司;DEX:Sigma公司;低糖DMEM培養(yǎng)基:Invitrogen Life Technologies公司;神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)液(neurobasal medium,NB):Gibco公司;Morris水迷宮儀:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;超凈工作臺:江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;恒溫CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo公司(250B型)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn):分組給藥:將60只大鼠隨機(jī)分為6組,具體分組、用藥見表1。

表1 大鼠分組情況列表Tab.1 List of the rats grouping

各組大鼠均給予注射0.2 mg/kg的DEX以維持體內(nèi)基礎(chǔ)GC水平［6］,需要給予Aβ的組別中的大鼠,注射Aβ前1天開始給予DEX,連續(xù)注射7 d,GC維持對照組給予等量0.4%乙醇溶媒。等量生理鹽水作為DEX的溶媒。DEX+Aβ組中的大鼠于CAl區(qū)注射給予4μL的Aβ。注射Aβ后的第5天對大鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,訓(xùn)練7 d,進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練和記錄方法參見文獻(xiàn)［7］,水迷宮直徑為150 cm,水深50cm。每天從不同的象限入水訓(xùn)練2次。第7天開始采用Morrismicrosoft基礎(chǔ)類應(yīng)用程序紀(jì)錄逃避潛伏期(escape latency)和游泳距離(swiming distance),從以上2個(gè)方面來評價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶改變［8］。

1.2.3 生化與分子實(shí)驗(yàn)

① 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng):參照Santos SF等［9］的方法進(jìn)行體外海馬神經(jīng)元的培養(yǎng):將孕18d的大鼠斷頭處死,取胚胎海馬組織,剪成小塊,37℃胰蛋白酶消化20min,用含10%胎牛血清的NB洗3次,篩網(wǎng)過濾,計(jì)數(shù),置于96孔培養(yǎng)板(每孔5×104個(gè)),37℃,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng),2～3 d換一次培養(yǎng)液,培養(yǎng)9 d后的海馬神經(jīng)元用于測定細(xì)胞活力和彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA損傷。

②MTT比色法測定細(xì)胞活力:將實(shí)驗(yàn)分為:單用DEX1組(1 μmol/L),單用 DEX10組(10μmol/L),單用 Aβl(1μmol/L),單用Aβ5(5μmol/L),DEX+Aβ組(1μmol/L DEX+1μmol/LAβ、1 μmol/L DEX+5μmol/LAβ、10 μmol/L DEX+1 μmol/LAβ、10 μmol/L DEX+5μmol/LAβ)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第9天,更換DMEM培養(yǎng)液(不加胎牛血清),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入含0.04%乙醇的無血清DMEM培養(yǎng)液或DEX,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后加入無血清DMEM培養(yǎng)液或Aβ,24 h后參照J(rèn)un DJ等［10］的方法測細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。

③彗星實(shí)驗(yàn)檢測海馬神經(jīng)元DNA損傷:實(shí)驗(yàn)分為:正常對照組(正常培養(yǎng)),單用DEX10組(10μmol/L)組,單用Aβ5組(5 μmol/L),和DEX10+Aβ5組(10 μmol/LDEX+5μmol/L Aβ)。按照相應(yīng)的濃度不同時(shí)間段加入到培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后,采用彗星實(shí)驗(yàn)(單細(xì)胞凝膠電泳)檢測海馬神經(jīng)元中DNA的損傷,彗星實(shí)驗(yàn)具體步驟參考Wang S等［11］研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,正態(tài)計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析,計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法;規(guī)定P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.01有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 DEX與Aβ合用對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 與GC維持對照組比較,GC維持+DEX1組及GC維持+DEX5組中大鼠的逃避潛伏期,游泳距離均有所縮小,但不具有顯著性差異;與GC維持對照組比較,GC維持+Aβ組中大鼠的逃避潛伏期和游泳距離均有延長趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與GC維持+DEX1組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與GC維持+DEX5組比較,GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長,具有顯著性差異(P＜0.01),第9、10天的游泳距離延長,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均延長,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX5+Aβ組第10天的逃避潛伏期顯著延長,具有顯著性差異(P＜0.01),并且第10天游泳距離也延長,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見表2)。

表2 DEX與Aβ合用對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Tab.2 Effect of DEX combined with Aβon learning and memory in rats

2.2 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元活力的影響 與溶劑對照組比較,單用DEX和單用Aβ在各濃度值對海馬神經(jīng)元的活力都無影響;與溶劑對照組比較,各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時(shí),都會(huì)使海馬神經(jīng)元的活力下降,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與相同濃度Aβ組比較,各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時(shí),都會(huì)使海馬神經(jīng)元的活力下降,差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見表3)。

表3 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元活力的影響Tab.3 The impact of DEX combined with Aβon the vitality of hippocampal neurons

2.3 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元彗星拖尾長度的影響

表4顯示DEX10組對海馬神經(jīng)元有輕度彗星拖尾現(xiàn)象,但與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Aβ5組對海馬神經(jīng)元有輕度彗星拖尾現(xiàn)象,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與溶劑對照組比較,DEX10+Aβ5組有嚴(yán)重彗星拖尾現(xiàn)象,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與Aβ5組比較,DEX10+Aβ5組有嚴(yán)重彗星拖尾現(xiàn)象,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,見表4),表明DEX10可進(jìn)一步促進(jìn)Aβ延長海馬神經(jīng)元彗星拖尾長度,增加海馬神經(jīng)元的損傷。

表4 DEX與Aβ合用對海馬神經(jīng)元DNA損傷的影響(μm)Tab.4 The impact of DEX combined with Aβon DNA damage in hippocampal neurons(μm)

3 討論

DEX和Aβ的聯(lián)合損傷作用具有協(xié)同或相加作用可能會(huì)促進(jìn)AD的發(fā)生和發(fā)展。Cheng A等［12］的研究證實(shí),神經(jīng)元細(xì)胞中DNA損傷能夠?qū)е律窠?jīng)元凋亡,能夠誘導(dǎo) AD發(fā)病。Ge YS等［13］的研究表明,較多的糖皮質(zhì)激素和Aβ對神經(jīng)元均有毒性。Kleen JK及其他學(xué)者［14-16］的研究表明,糖皮質(zhì)激素含量的增高會(huì)破壞海馬神經(jīng)元樹突的完整性,甚至可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的死亡。然而本研究結(jié)合動(dòng)物水平與分子水平對DEX與Aβ聯(lián)合作用對大鼠海馬組織損傷作用進(jìn)行研究,從微觀到宏觀揭示DEX與Aβ聯(lián)合引起大鼠海馬組織損傷的作用機(jī)制。

本研究中,大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示:與GC維持+DEX相應(yīng)濃度組比較,GC維持+DEX1+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均有延長;與GC維持+Aβ組比較,GC維持+DEX1、5+Aβ組第10天的逃避潛伏期和游泳距離均有延長;這說明DEX與Aβ合用比單用DEX或Aβ對大鼠學(xué)習(xí)記憶力下降影響大,這是由于DEX和Aβ聯(lián)合作用致大鼠海馬神經(jīng)元損傷程度要比單用DEX或Aβ的程度大;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:單用DEX和單用Aβ無論哪個(gè)濃度值對海馬神經(jīng)元的活力均無影響,而當(dāng)各濃度的DEX分別與不同濃度的Aβ合用時(shí),均會(huì)使海馬神經(jīng)元的活力下降,這說明DEX與Aβ合用從細(xì)胞水平上會(huì)降低海馬神經(jīng)元的活力,單用DEX或Aβ任何一種均對海馬神經(jīng)元的活力無影響,這可能與DEX會(huì)增強(qiáng)Aβ干擾鈣平衡和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)有關(guān),從而引起神經(jīng)元異常;彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:DEX10+Aβ5組分別與DEX10組和Aβ5組比較,都有較嚴(yán)重彗星拖尾現(xiàn)象,這從DNA水平說明DEX10+Aβ5合用會(huì)造成海馬神經(jīng)元損傷,其原因?yàn)镈EX與Aβ合用會(huì)損傷海馬神經(jīng)元中DNA。

總之,DEX與Aβ合用會(huì)降低大鼠海馬神經(jīng)元的活力,并且能夠損傷海馬神經(jīng)元中的DNA,從而降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。此研究對AD的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防有一定的實(shí)用價(jià)值。

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(編校:譚玲)

Experimental study of am yloidβprotein combined w ith dexamethasone on hippocam pal tissue damage

YUAN Xiao-ling1,WANG Jing-fang2,REN Hong-yan1,DONG Zi-feng1Δ,KONG Hui3

(1.Department of Neurology,Liaocheng People's Hospital,Liaocheng 252000,China;2.Dongchangfu People's Hospital of Liaocheng City,Liaocheng 252000,China;3.Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To explore the damage mechanisms of amyloid β protein combined with dexamethasone(DEX)on hippocampal tissue.Methods Morriswatermaze was used to detect effects of DEX combined with amyloid beta protein on learning and memory in rats.MTTmethod was used to detect influence of DEX combined with Aβprotein on vitality of rat hippocampal neurons.Comet assay was used to detect the damage extent of DEX combined with Aβprotein to rat hippocampal neurons DNA.Results Compared with the GC maintain+DEX1 group,the escape latency and swimming distance of rat in GCmaintain+DEX1+Aβgroups were prolonged on the tenth day,the difference was statistically significant(P＜0.05).Compared with GCmaintain+DEX5 group,the escape latency of GCmaintain+DEX5+Aβgroup was significantly prolonged on the 10th day,there was significant difference(P＜0.01),the swimming distance extension on the 9th and 10th day,the difference was statistically significant(P＜0.05).Compared with GCmaintain+Aβgroup,escape latency and swimming distance of GCmaintain+DEX1+Aβgroups were prolonged,the difference was statistically significant(P＜0.05).Compared with GCmaintain+Aβgroup,the escape latency ofGCmaintain+DEX5+Aβgroup was significantly prolonged on the 10th day,there was significant difference(P＜0.01),the swimming distance extension on the 10th day.Compared with the control group,each concentration of DEX combined with different concentrations of Aβdecreased activity of hippocampal neurons,the differencewas statistically significant(P＜0.05).Compared with the DEX10 group and Aβ5 group respectively,DEX10+Aβ5 group had amore severe comets smearing,there was significant difference(P＜0.01).Conclusion DEX+Aβgroup has greater impact on learning and memory decline than single Aβgroup or single DEX group.On the cellular level,DEX+Aβgroup will reduce the viability of hippocampal neurons,any ofwhich alone had no effect;the combination of DEX and Aβcan cause DNA damage in hippocampal neurons.

DEX;amyloidβ-protein;combination;rat;hippocampus tissue

袁曉玲，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管病方面，E-mail：13963528322@163.com；董子峰，通信作者，男，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科臨床，E-mail：2532644214@qq.com。

R749

A

1005-1678（2014)06-0071-04