肖麗,趙梅花,劉香環(huán),李坤

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031;2.山東省濟(jì)南市商河縣人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031)

丹參川芎嗪注射液對(duì)妊娠期高血壓模型大鼠的療效及胎盤細(xì)胞Cyclin B1和p21蛋白的影響

肖麗1,趙梅花2,劉香環(huán)1,李坤3

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031;2.山東省濟(jì)南市商河縣人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,山東 濟(jì)南 250031)

目的 探討丹參川芎嗪注射液對(duì)妊娠期高血壓大鼠模型的效果及對(duì)胎盤細(xì)胞CyclinB1、p21蛋白表達(dá)量的影響。方法將64只孕鼠隨機(jī)分為4組:正常妊娠大鼠作空白對(duì)照，妊娠高血壓大鼠作陰性對(duì)照，硫酸鎂治療組作陽(yáng)性對(duì)照，丹參川芎嗪注射液組為實(shí)驗(yàn)組；每組16只。妊娠14 d時(shí)，尾靜脈注射亞硝基左旋精氛酸甲酯建立妊娠期高血壓模型。從妊娠第14天開(kāi)始給藥，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組均給予與藥物同劑量的生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組給予硫酸鎂及丹參川芎嗪注射液治療，3 d為一個(gè)給藥療程。通過(guò)大鼠套尾法測(cè)量血壓，尾靜脈取血法測(cè)定24 h尿蛋白，并觀察各組妊娠大鼠所生新生鼠的身長(zhǎng)、體重、死胎率、后肢畸形率和胎盤重量，并通過(guò)免疫蛋白印跡法測(cè)定各組大鼠胎盤細(xì)胞中CyclinB1、p21蛋白表達(dá)量。結(jié)果 與空白組相比，陰性對(duì)照組孕鼠尿蛋白及血壓明顯增加，新生鼠的身長(zhǎng)、體重和胎盤重量均顯著降低，死胎率以及畸形率顯著增高（P＜0.05)；與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組孕鼠收縮壓及尿蛋白濃度均顯著降低，新生鼠的身長(zhǎng)、體重和胎盤重量均顯著升高，死胎率以及畸形率顯著減少（P＜0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組孕鼠CyclinB1蛋白濃度顯著下降（P＜0.05)，p21濃度顯著增高（P＜0.05)；與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組孕鼠CyclinB1蛋白濃度顯著升高（P＜0.05)，p21濃度顯著降低（P＜0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 川芎嗪注射液能夠顯著降低妊娠高血壓孕鼠的死胎率以及畸形率，改善新生鼠狀況，并且能夠上調(diào)cyclinB1以及下調(diào)p21表達(dá)，這可能是川芎嗪注射液治療效果的原因之一。

丹參川芎嗪注射液；妊娠期高血壓；CyclinB1蛋白；p21蛋白

妊娠期高血壓疾病是臨床上極為常見(jiàn)的妊娠期疾病,包括:妊娠期高血壓、原發(fā)高血壓并妊娠、繼發(fā)高血壓合并妊娠、先兆子癇等［1］。該疾病常常合并產(chǎn)科出血、感染、抽搐,是目前造成孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一。臨床研究表明,妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展與胎盤組織細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控蛋白表達(dá)失衡有一定的相關(guān)性,臨床治療該疾病目前以硫酸鎂為主［2］。但是,硫酸鎂治療該疾病面臨著毒性大的危險(xiǎn)。因而,需要尋找代替硫酸鎂的新型治療妊娠期高血壓疾病藥物成為研究熱點(diǎn)［3］。丹參川芎嗪注射液具有解痙、降壓作用,對(duì)心肌梗死、高血壓等疾病效果良好［4］。本研究以妊娠期高血壓大鼠為疾病模型,用丹參川芎嗪注射液治療獲得良好的效果,結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究選用清潔級(jí)雌性SD大鼠80只,大鼠體質(zhì)量220～260 g,購(gòu)自南京君科生物工程,合格證號(hào):SCXK(魯)2008-0020;再購(gòu)取80只雄性SD大鼠,體質(zhì)量220～260 g,實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物房中,保持室溫在18℃～28℃之間,環(huán)境清潔、光線適中、飲食正常。

1.2 研究方法

1.2.1 妊娠高血壓疾病模型建立:雌雄大鼠混養(yǎng),第二天檢查雌性大鼠陰道的精子,發(fā)現(xiàn)精子的大鼠計(jì)為妊娠大鼠,為妊娠第一天d1。將64只孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法均分為4組:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組,每組16只。將陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組孕鼠進(jìn)行妊娠高血壓模型建立:給予該3組大鼠于d14靜脈注射一氧化氮和酶抑制劑(美國(guó)Sigma),給藥劑量為7mg/(kg·d),連續(xù)4 d?？瞻讓?duì)照組大鼠:從d14開(kāi)始,每天定時(shí)給予靜脈注射生理鹽水800 uL/d,連續(xù)4 d。

1.2.2 給藥方法:空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組:于d18開(kāi)始,給予大鼠尾靜脈注射生理鹽水,0.8 mL/d,連續(xù)3 d。陽(yáng)性對(duì)照組:于 d18開(kāi)始,給予大鼠尾肌肉注射硫酸鎂溶液,100mg/(kg·d),連續(xù)3 d。實(shí)驗(yàn)組:于d18開(kāi)始,給予大鼠尾靜脈注射丹參川芎嗪注射液,10mg(kg·d),連續(xù)3 d。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 孕鼠血壓測(cè)量:應(yīng)用HX-II小動(dòng)物血壓測(cè)量計(jì)(北京明心痛生物科技有限公司),然后通過(guò)Medlab生物信號(hào)采樣分析系統(tǒng)(南京美易科技)通過(guò)套尾法測(cè)定大鼠尾部動(dòng)脈收縮壓。

1.3.2 24 h尿蛋白測(cè)定:從d14天開(kāi)始收集各組孕鼠24 h尿液,測(cè)定其體積,并且取其中1 mL通過(guò)考馬斯亮藍(lán)測(cè)定尿蛋白濃度。

1.3.3 胎盤組織處理:于 d21,采用10%的水合氯醛(3mL/kg)對(duì)孕鼠進(jìn)行麻醉。將大鼠進(jìn)行剖宮,測(cè)定胎鼠的身長(zhǎng)、重量、死胎率、畸形胎率。并取胎盤組織適量,用PBS洗2遍之后,用眼科剪剪碎,采用研磨器研成勻漿,通過(guò)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后,即得單細(xì)胞懸液。

1.3.4 CyclinB1以及p21蛋白的測(cè)定［5］:采用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)所獲得胎盤細(xì)胞中CyclinB1以及p21蛋白的表達(dá)量,具體操作步驟如下:收集取胎盤組織中的細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,冰上裂解提取蛋白。取30 ug定量樣品,用SDSPAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后用5%脫脂牛奶-TBST,室溫?fù)u床封閉2 h,一抗在37℃孵育3 h,二抗于37℃孵育1 h,ECL發(fā)光劑刺激熒光,壓片顯影定影。用灰度掃描儀處理分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件,對(duì)計(jì)數(shù)資料采用χ2分析,正態(tài)計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),用“±s”表示;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠血壓及尿蛋白濃度測(cè)定 給藥前,空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組孕鼠血壓以及尿蛋白濃度結(jié)果無(wú)顯著性差異,且與未妊娠的大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在建立模型前各雌鼠未孕。在建立模型之后,陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組收縮壓以及尿蛋白濃度均顯著高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在給藥治療后陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組孕鼠收縮壓及尿蛋白濃度均顯著高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 各組孕鼠血壓及尿蛋白濃度比較Tab.1 Comparison of blood pressure and urine protein concentration each group

2.2 各組孕鼠胎盤重量、死胎率、新生鼠情況比較 研究 結(jié)果顯示,在建立模型之后,陰性對(duì)照組新生鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、以及胎盤重量均顯著低于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組新生鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、以及胎盤重量均顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05),但實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;陰性對(duì)照組新生鼠死胎率、畸形率均顯著高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組以及陽(yáng)性對(duì)照組新生鼠死胎率、畸形率均顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)差異(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組孕鼠胎盤重量、死胎率、新生鼠情況比較ΔP＜0.05,與空白組相比;*P＜0.05,與模型組相比Fig.1 Comparison of placenta weight,body weight,body length,deformity rate and mortality in each groupΔP＜0.05,compared with control group;*P＜0.05,compared with model group

2.3 Western blot檢測(cè)cyclinB1、p21蛋白濃度結(jié)果 研究結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組孕鼠cyclinB1蛋白濃度顯著降低(P＜0.05),p21濃度顯著增高(P＜0.05);與陰性對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組孕鼠cyclinB1蛋白濃度顯著升高(P＜0.05),p21濃度顯著降低(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組cyclinB1、p21蛋白表達(dá)比較ΔP＜0.05,與空白組相比;*P＜0.05,與模型組相比Fig.2 Comparison of cyclinB1,p21 protein expression in each groupΔP＜0.05,compared with control group;*P＜0.05,compared with model group

3 討論

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾?。?］,也被稱為“胎盤病”。它是一組妊娠與高血壓并存的疾病,主要包括子癇前期、子癇、以慢性高血壓并發(fā)子癇前期以及妊娠期高血壓等［7］。多犯病于妊娠晚期,其典型癥狀主要由于高血壓、蛋白尿以及水腫。當(dāng)出現(xiàn)抽搐昏迷,血壓明顯增高,蛋白尿增多時(shí),則會(huì)危機(jī)母嬰的生命［8］。該疾病的發(fā)病率在我國(guó)目前達(dá)到9.4% ～10.4%［9］。是目前孕產(chǎn)婦以及圍生兒發(fā)病率、死亡率的主要原因之一［10］。因而,診斷及治療該疾病是婦產(chǎn)科研究的重點(diǎn)。目前,硫酸鎂是治療該疾病的主要藥物之一,但是,臨床研究表明,該藥物副作用大。因而,尋找更為有效且安全的藥物極為重要［11］。

丹參川芎嗪注射液包括丹參、鹽酸川芎嗪,并以甘油為輔料。丹參素能夠改善血管微循環(huán),能夠促進(jìn)纖維蛋白的溶解,使血液血流狀況得到改善,微循環(huán)障礙得到減輕,并且能夠延長(zhǎng)戊巴比妥對(duì)大腦皮層的作用,使大腦皮層自發(fā)活動(dòng)減少［12］。川芎嗪能夠增加血流量、改善微循環(huán),增加胎盤血流量,抑制血栓烷A的分泌。董喜英等［13］研究發(fā)現(xiàn)丹參注射液聯(lián)合小劑量阿司匹林治療妊娠期高血壓疾病,結(jié)果發(fā)現(xiàn)療效良好,值得臨床推廣。

CyclinB1蛋白是周期蛋白中的一種,能夠與細(xì)胞核內(nèi)的Cdk1結(jié)合成復(fù)合物,該復(fù)合物倍cdc25c活化之后才能導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂［14］。p21蛋白是一種廣泛應(yīng)用的細(xì)胞周期復(fù)興調(diào)控因子,能夠抑制CDK1,與其特異性結(jié)合使其失活,使細(xì)胞周期被阻滯,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［15］。

本研究通過(guò)建立妊娠期高血壓大鼠模型,采用丹參川芎嗪注射液及硫酸鎂治療該大鼠模型。結(jié)果顯示:丹參川芎嗪注射液與硫酸鎂在改善大鼠血壓以及尿蛋白濃度方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,對(duì)新生鼠的身長(zhǎng)、胎盤重量方面差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明丹參川芎嗪能夠起到很好的降血壓,治療妊娠高血壓的作用,并且副作用小。通過(guò)測(cè)定胎盤細(xì)胞CyclinB1蛋白以及p21蛋白發(fā)現(xiàn),丹參川芎嗪注射液能夠上調(diào)CyclinB1蛋白以及下調(diào)p21蛋白的表達(dá),這可能是該注射液能夠治療大鼠妊娠期高血壓的機(jī)制之一。目前該藥物還僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ碗A段,其應(yīng)用于臨床還有待進(jìn)一步研究。

［1］ De Vera MA，Bérard A.Antidepressant use during pregnancy and the risk of pregnancy-induced hypertension［J］.British journal of clinical pharmacology，2012，74（2):362-369.

［2］ Katon WJ，Russo JE，Melville JL，et al.Depression in pregnancy is associated with preexisting butnot pregnancy-induced hypertension［J］.General hospital psychiatry，2012，34（1):9-16.

［3］ 張波，溫權(quán)，甘元華.丹參川芎嗪注射液治療高血壓腦出血對(duì)外周血C反應(yīng)蛋白的影響研究［J］.中國(guó)藥物與臨床，2013，13（12):1599-1600.

［4］ Honetschlagerova Z，Kitada K，Huskova Z，et al.Antihypertensive and renoprotective actions of soluble epoxidehydrolaseinhibitionin ANGII-dependentmalignant hypertension are abolished by pretreatmentwith LNAM［J］.JHypertens，2013，31（2):321-332.

［5］ 席偉，王建生，張明潔.丹參川芎嗪注射液治療妊娠期高血壓疾病對(duì)患者Hcy和VWF水平的影響［J］.微循環(huán)學(xué)雜志，2013，43（3):35-36.

［6］ 樂(lè)杰，謝幸，豐有吉.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:97-104.

［7］ 郭玲，左慧君，劉絲蓀.妊娠期高血壓疾病病因?qū)W的研究進(jìn)展［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，32（4):414-418.

［8］ Shiozaki A，Matsuda Y，Satoh S，et al.Impact of fetal sex in pregnancyinduced hypertension and preeclampsia in Japan ［J］.Journal of reproductive immunology，2011，89（2):133-139.

［9］ 范靜，李會(huì)琴，郭櫻.丹參川芎嗪對(duì)妊娠期高血壓疾病大鼠的療效分析［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展.2013，22（9):73-75.

［10］梁躍雄.丹參川芎嗪對(duì)高血壓性腦出血血腫吸收及神經(jīng)功能的影響［J］.臨床與實(shí)踐，2012，9（11):32-33.

［11］ Felipe Flores-Suarez， Rainer Birck.Herbal treatments of glomerulonephritis and chronicrenal failure:Review and recommendations for Research ［J］.Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy，2011，3（9):124-136.

［12］ Wilson M L，Brueggmann D，Desmond D H，et al.A fetal variant in the GCM1 gene is associated with pregnancy induced hypertension in a predominantly hispanic population ［J］.International journal of molecular epidemiology and genetics，2011，2（3):196.

［13］董喜英，王春霞，李錄花.丹參注射液聯(lián)合小劑量阿司匹林治療妊娠期高血壓疾病療效觀察［J］.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2014，17（8):1284-1286.

［14］ May M，Wang T，Muller M，etal.Difference in F-Actin depolymerization induced by toxin B from the variant clostridium difficile serotype F striain 1470［J］.Toxins（Basel)，2013，5（1):106-119.

［15］ Ehrenthal DB，Jurkovitz C，Hoffman M，et al.Prepregnancy body mass index as an independent risk factor for pregnancy-induced hypertension［J］.Journal ofWomen's Health，2011，20（1):67-72.

(編校:吳茜)

Effect of salvia ligustrazine injection on the efficacy of hypertension pregnancy model ratsand the expression of placental cell Cyclin B1 and p21 protein

XIAO Li1,ZHAOMei-hua2,LIU Xiang-huan1,LIKun3

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital of Shandong Province,Ji'nan 250031,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,People's Hospital of Shanghe county,Ji'nan 250031,China;3.Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences,Ji'nan 250031,China)

Objective To investigate the effects of salvia injection on the effect of TMP ratmodel of hypertension in pregnancy and placental cells CyclinB1,p21 protein expression.Methods 64 rats during pregnancywere divided into four groups:normal pregnant rats as control,pregnancy-induced hypertension rats as negative control,pregnancy-induced hypertension rats treated with magnesium sulfate as positive control,pregnancy-induced hypertension rats treated with salvia ligustrazine injection as experimental group,each had 12 rats.Control group and negative group ratswere given the same dose of the drug saline;positive group and the experimental group were separately givenmagnesium sulfate and salvia ligustrazine injection therapy,three days a dosing regimen.Blood pressure in rats tailsweremeasured,24 h urine protein though tail vein blood were determined,newborn ratsweight,still birth rate,limb deformity rate and placental weight of pregnant rats in each group were observed,and placental cell CyclinB1,p21 protein expression were detected by Western blott.Results Compared with control group,blood pressure and urine protein of pregnant rats in negative control group,were increased significantly(P＜0.05),neonatal height,weight and placentalweightwere decreased significantly(P＜0.05),and the stillbirth rate andmalformation ratewas significantly higher(P＜0.05).Compared with negative controlgroup,blood pressure and urine protein of pregnant rats in positive control group and experimental group were decreased significantly(P＜0.05),neonatal height,weight and placental weight were increased significantly(P＜0.05)and the stillbirth rate and malformation rate was significantly lower(P＜0.05).There were no significant differences of thoseindexes between positive control group and experimental group.Compared with control group,cyclinB1 protein expression in negative control group was decreased(P＜0.05),and p21 was significantly increased(P＜0.05),Compared with negative control group,cyclinB1 protein expression in positive control group and experimental group were all increased(P＜0.05),ang p21 was significantly decreased(P＜0.05).There were no significant differences of those indexes between positive control group and experimental group.Conclusion TMP injection can significantly reduce pregnancyinduced hypertension in pregnant rats and deformity rate,stillbirth rate,neonatal rats situation also improved,and can increase cyclinB1 expression and decrease p21 expression,which may be one of the therapeutic effect of TMP injection reasons.

salvia ligustrazine injection;gestational hypertension;CyclinB1 protein;p21 protein

TQ460.7

A

1005-1678（2014)06-0055-04

山東省自然科學(xué)基金課題(ZR2009CL027)；濟(jì)南市科技局科技明星計(jì)劃課題(20100118)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)基金課題(201023)

肖麗，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：妊娠期高血壓，E-mail：qch1821460022@163.com。