蘇立平,薛明明△,陳立,蘇立軍,祁朋,何蕾

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059;2.中國國際航空內(nèi)蒙古分公司 航醫(yī)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 生殖中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

蛇床子素對大鼠肝癌動物模型肝細(xì)胞生物行為學(xué)特性及血管特征的影響

蘇立平1,薛明明1△,陳立2,蘇立軍3,祁朋3,何蕾3

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059;2.中國國際航空內(nèi)蒙古分公司 航醫(yī)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 生殖中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

目的 探討蛇床子素對二乙基亞硝胺致癌和Walker-256移植瘤Wistar大鼠的生物行為學(xué)特性及血管特征的影響。方法 選取造模成功的二乙基亞硝胺致癌和Walker-256移植瘤的Wistar大鼠各20只，前者均分為A組和C組，后者均分為B組和D組，A、B 2組給予等體積的生理鹽水灌胃，為對照組；C、D 2組給予2.5μg/（g·d)蛇床子素灌胃，為治療組。治療4周后，對各組進(jìn)行微血管直徑的測量，腫瘤微血管密度的計數(shù)，腫瘤直徑的測量，腫瘤分化程度評價以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)。結(jié)果 治療4周后，C組腫瘤直徑較A組明顯降低（P＜0.01)，D組腫瘤直徑較B組有一定程度的降低（P＜0.05)；C組較A組，D組較B組大鼠的門脈癌栓率均顯著性降低（P＜0.01)；2治療組腫瘤細(xì)胞分化程度有一定程度的升高，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；微血管密度和微血管直徑C組較A組，D組較B組均有一定程度的降低（P＜0.05)。C組較A組，D組較B組腫瘤瘤塊體積均明顯降低（P＜0.01)。A、B組血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，C、D組經(jīng)過蛇床子素4周治療后，血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)均明顯降低。結(jié)論 蛇床子素可通過影響肝細(xì)胞癌生物行為學(xué)特性及血管特征而抑制2種肝癌實驗動物模型肝癌的生長。

蛇床子素；肝癌；生物行為學(xué)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界范圍內(nèi)是第五大常見腫瘤,且發(fā)病率還在逐年增加［1］。目前仍以手術(shù)切除和化療藥物治療為主,但是化療藥物能夠引起眾多不良反應(yīng),且多是不可避免的。許多從天然植物中提取的化學(xué)成分能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,本研究中的蛇床子素是中藥蛇床子的主要有效成分,具有抑制肺腺癌腫瘤生長的作用［2］。本研究旨在探討蛇床子素對二乙基亞硝胺致癌和Walker-256移植瘤的Wistar大鼠肝細(xì)胞癌生物行為學(xué)特性及血管特征的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細(xì)胞:雄性Wistar大鼠6周齡,體質(zhì)量120～200 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,合格證號:SCXK(京)2013-0001。飼養(yǎng)條件:于無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級分籠飼養(yǎng),每籠2～4只,采用自然光照,并定時通風(fēng),保持環(huán)境清潔,溫室保持在19℃～23℃,相對濕度為70%～80%。本實驗嚴(yán)格遵循《實驗動物保護(hù)條例》的相關(guān)規(guī)定。

Walker-256細(xì)胞由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.1.2 試劑和藥材:蛇床子素由江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司提供,使用時用N,N-二甲基甲酰胺溶解,采用吐溫80助溶,溶解比例為:N,N-二甲基甲酰胺∶吐溫80∶生理鹽水=1∶1∶8,使用前用生理鹽水稀釋至所需濃度。注射二乙基亞硝胺(Sigma公司)。免疫組化超敏 S-P試劑盒購自美國 Maxim公司。nm23-H(美國Maxim公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立:二乙基亞硝胺致癌大鼠模型的建立參照Park等［3］所報道的方法并在具體操作時稍加改進(jìn)。即:模型組大鼠腹腔注射二乙基亞硝胺溶液(50mg/kg,用生理鹽水超聲溶解至0.1mL),2次/周,連續(xù)注射4周后,改為同樣劑量的1次/周,到第14周結(jié)束后,隨機(jī)處死1只大鼠,檢查肝臟出現(xiàn)癌灶者則造模成功。

Walker-256移植瘤大鼠模型建立:Walker-256細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL,取0.2 m L注射于大鼠右后腿皮下,每隔1周測量瘤體的長度(L)和寬度(W),瘤體體積計算［4］:V(mm3)=0.5236 ×L(nun) ×W2(mm2)。 瘤體體積至(100±20)mm3時開始實驗。

1.2.2 治療方法:將20只二乙基亞硝胺致癌成功的Wistar大鼠隨機(jī)分為A組和C組,20只Walker-256移植瘤成功的Wistar大鼠隨機(jī)分為B組和D組,A、B 2組給予生理鹽水,為對照組;C、D 2組給予2.5μg/(g·d)蛇床子素灌胃,為治療組。治療4周后,采用吸入乙醚法處死大鼠,剖取癌灶及距癌灶邊緣1 cm癌旁組織,用10%甲醛溶液固定,標(biāo)本保存在-80℃冰箱。

1.2.3 檢測指標(biāo):肝癌生物行為學(xué)特性:治療4周后,切除各組肝癌組織,檢測腫瘤直徑、門脈癌栓和腫瘤細(xì)胞分化程度生物行為學(xué)特性參數(shù)。

肝癌組織微血管密度和微血管直徑:對切除的肝癌組織,行肝癌組織切片,連續(xù)切取5μm厚的3張切片,其中1張進(jìn)行常規(guī)HE染色,另外2張進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組化染色。利用顯微鏡尋找切片血管高密度區(qū),計數(shù)被染成棕色的血管數(shù)目,每個高密度區(qū)計數(shù)3個視野,最高值即為微血管密度值。顯微鏡下,于血管高密度區(qū)隨機(jī)測量5個相同倍數(shù)視野下的血管,計算最大橫徑的平均值,即為腫瘤微血管直徑。

免疫組織化學(xué)法觀察各組肝癌組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)。各組處理后的切片采用S-P法進(jìn)行VEGF表達(dá)的檢測,一抗(1∶500)使用nm23-H(美國Maxim公司),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃棕色顆粒即為陽性細(xì)胞。

腫瘤瘤塊體積測定:瘤塊體積(tumor volume,TV)采用公式:TV=(a×b)2/2計算,其中a代指瘤體的長,b代指瘤體的寬。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS19.0軟件處理統(tǒng)計數(shù)據(jù),正態(tài)計量資料以“±s”表示,進(jìn)行t檢驗,計數(shù)資料組間對比采用χ2檢驗;以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝細(xì)胞癌生物行為學(xué)特性及血管特征 經(jīng)過蛇床子素4周治療后,C組腫瘤直徑較A組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),D組腫瘤直徑較B組有一定程度的降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);大鼠門脈癌栓情況,C組較A組,D組較B組均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);腫瘤細(xì)胞分化程度有一定程度的升高,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。微血管密度和微血管直徑C組較A組,D組較B組均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組肝細(xì)胞癌生物行為學(xué)特性及肝細(xì)胞癌血管特征Tab.1 Bio-behavioral characteristics of hepatocellular carcinoma and The vascular characteristics of hepatocellular carcinoma in each group

2.2 各種腫瘤瘤塊體積測定 經(jīng)過蛇床子素4周治療后,治療組(C、D組)較對照組(A、B組)腫瘤瘤塊體積均有明顯的降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,見圖1)。

圖1 腫瘤瘤體體積**P＜0.01,與A組比較;##P＜0.01,與B組比較Fig.1 The tumor volume of tumor block**P＜0.01,compared with group A;##P＜0.01,compared with group B

2.3 各組VEGF表達(dá)檢測結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示:A、B組肝癌組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量黃棕色顆粒(文中箭頭所示,見圖2A,2B),C、D組肝癌組織細(xì)胞內(nèi)黃棕色顆粒明顯減少(見圖2C,2D),表明A、B組血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),經(jīng)過蛇床子素4周治療后,血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)明顯降低。

圖2 各組VEGF表達(dá)檢測Fig.2 Immunohistochemistry assay results of VEGF expression in each group

3 討論

中藥在我國有著悠久的歷史,其在腫瘤治療方面發(fā)揮著越來越重要的作用,其中不乏治療肝癌的藥物［5-6］。蛇床子素又稱甲氧基歐芹酚,屬于香豆素類化合物,而香豆素已被證實具有抗肝癌的效果［7］。國內(nèi)外研究表明,蛇床子素不僅具有抗肝炎、抗骨質(zhì)疏松等作用［8-9］,而且可以通過誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤增殖［10］。研究顯示:蛇床子素對肺癌裸鼠模型的實體瘤的生長具有一定的抑制作用,而對小鼠的肝、腎、脾指數(shù)影響甚微,體現(xiàn)蛇床子素低毒的特點(diǎn)［2］。

腫瘤的惡性程度與其分化程度有關(guān)［11］,有報道顯示中藥可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的分化而降低其惡性程度［12］。本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素具有抑制2種肝癌動物,即二乙基亞硝胺致癌和Walker-256移植瘤的Wistar大鼠肝癌細(xì)胞的生長作用,使肝癌細(xì)胞高分化,從而降低其侵襲能力,但其促使肝癌細(xì)胞高分化的機(jī)制仍不清楚,需要進(jìn)一步研究。腫瘤的生長伴隨著大量微血管的形成［13］,本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素能降低腫瘤微血管密度,減小微血管直徑,從而抑制腫瘤的生長。本研究還通過免疫組化實驗證實,蛇床子素能夠降低肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá),這可能是其影響腫瘤微血管作用的原因,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,蛇床子素對肝癌實驗動物模型的腫瘤具有一定的抑制作用,且可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(編校:吳茜，王儼儼)

Effect of osthole on the bio-behavioral characteristics and vascular characteristics in hepatocellular carcinoma model rat

SU Li-ping1,XUE Ming-ming1△,CHEN Li2,SU Li-jun3,QIPeng3,HE Lei3

(1.Laboratory of Basic Medical Science,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China;

2.Aviation Medical Center,Inner Mongolia Branch of Air China,Hohhot010070,China;

3.Reproductive Center,Inner Mongolia Medical University,Hohhot010059,China)

Objective To investigate the effectof osthole on the bio-behavioral characteristics and vascular characteristics in N-nitrosodiethylamine and Walker-256 transplantable tumorWistar rats.Methods 20 ratswith N-nitrosodiethylamine-induced tumor were divided into A,C group,another 20 ratswith Walker-256 transplantable tumorWistar ratswere divided into B,D groups,each had 10 rats.Rats in group A and Cwere given certain saline as control groups,and rats in group B and D were given 2.5μg/(g·d)osthole gavage treatment.After 4 weeks treatment,capillary diameter,tumor microvessel density,tumor diameter,tumor differentiation ofeach group weremeasured and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in each group weremeasured by immunohistochemistry assay.Results After4 weeks osthole treatment,tumor diameter of group Cwas significantly lower than that of group A(P＜0.01),and group Dwas significantly lower than thatofgroup B(P＜0.05).Ratio of portal thrombosis in group C and Dwere significantly lower than thatof group A and group B,respectively(P＜0.01).The degree of tumor cell differentiation were increased in group C and D,and there were no significant difference with two control group.Microvascular density and microvascular diameter in group C and D were significant lower than that in group A and B,respectively(P＜0.05).Tumor volumes in treatment groups(C and D)were significantly lower than that in control groups(A and B,P＜0.01).VEGF showed high expression in group A and B,and decreased in groups C and D after 4 weeks osthole treatment.Conclusion Osthole could inhibit hepatocellular carcinoma growth in two experimental animal models by influencing the bio-behavioral characteristics of hepatocellular carcinoma and vascular characteristics.

osthol;hepatocellular carcinoma;vascular;bio-behavioral characteristics

蘇立平，男，碩士，實驗師，研究方向：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗，E-mail：suliping1975@163.com；薛明明，通信作者，女，教授，研究方向：生理學(xué)，E-mail：1072730663@qq.com。

R285.5；R730

A

1005-1678（2014)06-0035-03

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2013MS1143)