王心曉,程小珍

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院 呼吸內(nèi)科,海南 ?？?570208;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院 腫瘤科,海南 ?？?570208)

CD13分子對(duì)非小細(xì)胞肺癌浸潤(rùn)Treg細(xì)胞免疫抑制的機(jī)制研究

王心曉1,程小珍2

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 海口市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,海南 ?？?570208;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院 腫瘤科,海南 ?？?570208)

目的 通過(guò)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)組和正常對(duì)照組中CD13分子與CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)，研究CD13分子對(duì)NSCLC浸潤(rùn)Treg細(xì)胞免疫抑制的機(jī)制。方法 隨機(jī)選取2013年6月～2014年5月間中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院收治的NSCLC患者160例為NSCLC組，選取同期因其他肺部疾病行手術(shù)切除的患者60例作為正常對(duì)照組。采用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR和免疫組化檢測(cè)2組CD13分子與CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)，并進(jìn)行比較。結(jié)果 對(duì)照組中CD13和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA的表達(dá)均顯著低于NSCLC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；CD13分子在NSCLC組的表達(dá)明顯多于對(duì)照組:對(duì)照組中有12例（20.0%)CD13呈陽(yáng)性表達(dá)，NSCLC組患者中有131例呈陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；NSCLC組的CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平（24.1±6.3)顯著高于對(duì)照組（0.7±2.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論 CD13分子可降低組織相容性復(fù)合物Ⅱ（MHCⅡ)的粘附抗原決定簇，從而降低T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的識(shí)別能力，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫無(wú)應(yīng)答或免疫耐受。這可能是CD13分子對(duì)非小細(xì)胞肺癌浸潤(rùn)Treg細(xì)胞免疫抑制的主要分子機(jī)制。

CD 13分子；非小細(xì)胞肺癌；Treg細(xì)胞；免疫抑制

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤之一,其發(fā)病率已經(jīng)位居腫瘤性疾病的首位,而且還有逐年升高的趨勢(shì),肺癌已經(jīng)成為當(dāng)今癌癥首要致死原因。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%,明確診斷時(shí)已有70%左右發(fā)展成為晚期或轉(zhuǎn)移性肺癌［1-2］。大量證據(jù)顯示肺癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)［3-4］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群,研究表明只有CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能［5-6］。CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞的免疫無(wú)應(yīng)答和免疫抑制使得腫瘤免疫逃逸,從而抑制機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫清除［7-8］。研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌患者外周血中的Treg細(xì)胞明顯升高,而且Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血中的Treg細(xì)胞水平明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者［9-10］。因此,調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制成為腫瘤免疫治療的主要障礙。CD 13分子是一種細(xì)胞膜糖蛋白,又名氨基膚酶N(aminopeptidase N,APN)。研究發(fā)現(xiàn)CD 13分子蛋白在腫瘤細(xì)胞的表面大量表達(dá),可以降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,從而參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)［11-12］。此外,CD 13分子能夠降解白細(xì)胞介素(IL-8),從而降低機(jī)體免疫功能;降低組織相容性復(fù)合物Ⅱ(major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ)的粘附抗原決定簇,從而降低T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的識(shí)別能力,導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫無(wú)應(yīng)答或免疫耐受［13-14］。為了進(jìn)一步研究CD 13分子對(duì)非小細(xì)胞肺癌浸潤(rùn)Treg細(xì)胞免疫抑制的機(jī)制,本課題(研究)隨機(jī)選取2013年6月～2014年5月間本院收治的NSCLC患者160例和正常對(duì)照組60例作為研究對(duì)象,對(duì)2組CD 13分子和CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行分析比較?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2013年6月～2014年5月間本院收治的NSCLC患者160例和正常對(duì)照組60例作為研究對(duì)象。其中男性130例,女性90例;年齡35～80歲,平均年齡(59.87±9.23)歲,年齡選取無(wú)顯著差異。NSCLC患者納入標(biāo)準(zhǔn):①外科手術(shù)切除后冰凍和常規(guī)處理證實(shí)病理類(lèi)型為鱗癌和腺癌;②臨床無(wú)其他惡性腫瘤的證據(jù);③近1個(gè)月未經(jīng)放化療治療;④近3個(gè)月未使用過(guò)免疫增強(qiáng)劑。

1.2 材料 CD13:上游5'-TCCGGAATTCATGGCCAAGGGCTTCTATATTTC-3';下游5'-CCGGATTTAAATC-TATTTGCTGTTTTCTGTGAACCACTG-3'。 CD4+CD25+FoxP3+Treg:上游 5'-GCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAG-3';下游5'-GTGGAGGAACTCTGGGAATGTG-3'。β-actin(內(nèi)參基因)引物序列:上游 5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3';下游5'-ATGTCACGCCACGATTTCC-CGC-3'。以上引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。均用焦炭酸二乙醇溶解,最終濃度為1 pmol/μL。

Trizol RNA提取試劑盒,美國(guó)Invitrogen公司公司),M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)NEB公司),5 U/uL Taq DNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司);CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞MACS分離試劑盒(德國(guó)美天妮公司)。

CD 13兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Epitomics公司);兔抗人Foxp3單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);二抗為羊抗兔免疫球蛋白(美國(guó)DAKO公司);SP免疫組化試劑盒(上海信然生物技術(shù)有限公司);DAB顯色劑(北京中杉金橋公司)

1.3 方法

1.3.1 取材:標(biāo)本取材后用PBS緩沖液淋洗3次,于離體20 min之內(nèi)取新鮮的組織60 mg,立即凍存于-72℃冰箱。異位子宮內(nèi)膜組織經(jīng)HE染色后在光鏡下確定異位的腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞。待檢測(cè)標(biāo)本于2 h之內(nèi)提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,置于-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ溆嗟臉?biāo)本均用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定,并經(jīng)乙醇脫水和石蠟包埋,再用切片機(jī)連續(xù)切片［15］。

1.3.2 RT-PCR擴(kuò)增CD 13和CD4+CD25+FoxP3+Treg:具體實(shí)驗(yàn)操作按照RT-PCR試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行,反應(yīng)體系為50 uL,94℃下先預(yù)變性4min,然后按照94℃,30 s;60℃,60 s;72℃,120 s,反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后在72℃下延伸10min。取RT-PCR的產(chǎn)物10 uL,置于2%的瓊脂糖凝膠中電泳,相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用puc Mix Marker,使用凝膠掃描系統(tǒng)對(duì)目的基因和β-actin基因進(jìn)行光密度掃描,目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值反映該目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)CD 13和CD4+CD25+FoxP3+Treg:采用免疫化學(xué)SP法進(jìn)行。選擇視野清晰的高倍鏡視野進(jìn)行觀(guān)察,然后按照著色程度和著色的百分比來(lái)評(píng)分。得分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比:＜5%為0分,5%～10%為1分,11%～50%為2分,51%～75%為3分,＞75%為4分。結(jié)果分為4級(jí):1～3分為陰性(-),4～5分為弱陽(yáng)性(+),6～7分為中陽(yáng)性(++),8分以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。正態(tài)計(jì)量資料以“±s”表示,組間比較用t檢驗(yàn);等級(jí)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和NSCLC組中CD 13分子和CD4+CD25+FoxP3+Treg的mRNA表達(dá) 使用 RT-PCR法檢測(cè) CD 13和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA在對(duì)照組和SCLC組中的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組中CD 13和CD4+CD25+FoxP3+Treg mRNA的表達(dá)均顯著低于NSCLC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,見(jiàn)表 1、圖 1)。

表1 2組CD 13分子和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA表達(dá)比較Tab.1 Comparison of CD 13 and CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA expression beween two groups

圖1 2組CD 13和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA的表達(dá)*P＜0.05,與NSCLC比較Fig.1 Them RNA expression of CD 13 and CD4+CD25+FoxP3+Treg in two groups*P＜0.05,compared with NSCLC group

2.2 CD 13分子蛋白在對(duì)照組和NSCLC組中的表達(dá)CD13分子蛋白在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)多,在正常對(duì)照組中表達(dá)較少,見(jiàn)圖2。由表2可知,60例對(duì)照組中CD 13蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為20.0(12/60),同期160例非小細(xì)胞肺癌中有131例(81.9%)CD 13蛋白呈陽(yáng)性表達(dá),明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 CD 13分子在對(duì)照組和NSCLC組中的表達(dá)(SP,×400)Fig.2 The expression of CD 13 in NSCLC and control groups(SP,×400)

表2 CD 13分子在對(duì)照組和NSCLC組中的表達(dá)Tab.2 The expression of CD 13 in NSCLC and control groups

2.3 CD4+CD25+FoxP3+Treg在對(duì)照組和NSCLC組中的表達(dá) 鏡下可見(jiàn)CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞形態(tài)完整,結(jié)構(gòu)清晰,散在分布于腫瘤組織中,尤其在正常組織與癌組織的交界處密集分布。由圖3和表3可知,NSCLC組織中 CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)水平(24.1±6.3)顯著高于正常對(duì)照組(0.7±2.1),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 CD4+CD25+FoxP3+Treg在對(duì)照組和NSCLC組中的表達(dá)(SP,×400)Fig.3 The expression of CD4+CD25+FoxP3+Treg in NSCLC and control groups(SP,×400)

表3 CD4+CD25+FoxP3+Treg在對(duì)照組和NSCLC組中的表達(dá)Tab.3 The expression of CD4+CD25+FoxP3+Treg in NSCLC and control groups

3 結(jié)論

人CD13基因位于染色體的15q25-26,其基因編碼序列包含有20個(gè)外顯子,表達(dá)受近端和遠(yuǎn)端兩個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。CD13蛋白是一種膚鏈端水解酶,由967個(gè)氨基酸組成,分子量150 kD左右。一般表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞膜的表面,當(dāng)腫瘤細(xì)胞自我復(fù)制增殖時(shí),CD13分子會(huì)遷移到細(xì)胞與細(xì)胞的接觸部位,通過(guò)水解基底膜的基膜和基底膜蛋白來(lái)激活信號(hào)轉(zhuǎn)換通路,從而參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［16-17］。目前,在許多實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了CD13的高表達(dá)。推測(cè)其在腫瘤細(xì)胞中主要起一下幾種作用［18-19］:①增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性,有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移;②促進(jìn)腫瘤血管的生成,有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)外界供養(yǎng)不足時(shí),血管生成因子VEGF可誘導(dǎo)CD13的表達(dá),促進(jìn)新血管的生成;③通過(guò)降解IL-8、MHCⅡ型粘附抗原決定簇降低T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別能力,從而加速腫瘤細(xì)胞的增值和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。研究表明,CD13抑制劑可降低腫瘤細(xì)胞的侵襲力,破壞毛細(xì)血管網(wǎng)的形成,延長(zhǎng)NSCLC患者的生存期。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的特殊T細(xì)胞亞群。研究表明非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平顯著高于健康人,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,隨著化療病情好轉(zhuǎn)后CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平也有所下降。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原能夠活化Treg細(xì)胞,從而抑制機(jī)體腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答,導(dǎo)致腫瘤逃逸。因此,Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制成為腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制。

本研究組采用RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者和正常對(duì)照組中CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達(dá)。研究結(jié)果顯示,NSCLC患者CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組,提示非小細(xì)胞肺癌患者免疫功能失調(diào)與機(jī)體CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達(dá)水平可能相關(guān)。這也提示是否能通過(guò)抑制體內(nèi)CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平治療非小細(xì)胞肺癌,以提高患者的生存率。

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(編校:吳茜)

Study on themechanism of CD 13 molecule on Treg cell immune suppression of non-small cell lung cancer patients

WANG Xin-xiao1,CHEN Xiao-zhen2

(1.Department of Respiratory Medicine,Haikou City People's Hospital,Central South University Xiangya Medical College Hospital,Haikou 570208,China;2.Department of Oncdogy,Medicine,Haikou City People's Hospital,Central South University Xiangya Medical College Hospital,Haikou 570208,China)

Objective To detect the expression of CD 13 molecule and CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in NSCLC and control groups,in order to investigate themechanism of CD 13 molecule on Treg cell immune suppression of NSCLC patients.Methods 160 cases of NSCLC patients from June 2013 to May 2014 in our hospitalwere selected,and another 60 caseswithout NSCLCwere selected as control group.The expression of CD 13 molecule and CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in NSCLC and control groupswere detected by RT-PCR and immunehistochemistry.Results ThemRNA expression of CD 13 and CD4+CD25+FoxP3+in control group were significantly lower than that in the NSCLC group(P＜0.05).The expression of CD 13 protein in NSCLC group was significantly higher than that in control group.The positive expression rate of the control group were only 20.0%(12/60),and increased to 81.9%(131/160)in NSCLC group,the differencewas statistically significant(P＜0.05).The expression level of CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in NSCLC(24.1±6.3)was significantly higher than that in the control group(0.7±2.1,P＜0.05).Conclusion The CD13 molecule can reduce MHCⅡepitope,thereby reducing the recognition ability of T cells to tumor cell,leading to no response or immune tolerance of tumor cell.This the possiblemainmechanism of CD 13 molecule on Treg cell immune suppression of non-small cell lung cancer patients.

CD 13 molecuar;non-small cell lung cancer;regulatory T cells;immune suppression

R734

A

1005-1678（2014)06-0011-04

海南省衛(wèi)生廳科研課題(瓊衛(wèi)2010-70)

王心曉，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸臨床及基礎(chǔ)，E-mail：hnhx123456@sohu.com。