王穎,郭人花

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453100;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,江蘇 南京 210029)

miR-181a-5p在非小細(xì)胞肺癌中抗癌機(jī)制的研究

王穎1,郭人花2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453100;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,江蘇 南京 210029)

目的 探索miR-181a-5p的抑癌機(jī)制，探討其是否可作為臨床檢測(cè)肺癌的標(biāo)志物。方法 采用CCK8法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響；利用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)探討miR-181a-5p與靶基因的相互作用。結(jié)果 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549中過(guò)表達(dá)miR-181a-5p能明顯抑制A549細(xì)胞株的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的早期凋亡（P＜0.05)。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-181a-5p能明顯抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)（P＜0.05)；miR-181a-5p可通過(guò)3'UTR靶向下調(diào)Kras基因的表達(dá)，且在NSCLC中Kras表達(dá)與miR-181a-5p表達(dá)有一定關(guān)系。結(jié)論 miR-181a-5p可顯著抑制NSCLC A549細(xì)胞的生物進(jìn)程，是潛在的治療NSCLC的靶標(biāo)。

miR-181a-5p；增殖；遷移；凋亡；非小細(xì)胞肺癌

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,miRNA通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)影響細(xì)胞功能,起抑癌或促癌作用［1-2］。起抑癌作用的miRNA主要通過(guò)調(diào)控功基因來(lái)抑制細(xì)胞的增殖、遷移或促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生［3-8］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 FLx8酶標(biāo)儀(BIO-RAD),C1000TMThermal Cycler PCR儀(BIO-RAD),TGL-18000-CR高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器制造有限公司),SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(蘇靜安泰有限公司),SW-CJ-2F多功能脫色搖床(上海智成分析儀器制造有限公司),XW-80A漩渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司),JY92-11超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司),PK-SZZ電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),PL203電子分析天平(METTLER TOLEDO上海有限公司),CFX96qRT-PCR儀(BIO-RAD),LRH-250F CO2恒溫培養(yǎng)箱(SHELLAB),MLS-3708高壓滅菌鍋(SANYO)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素105IU/L、鏈霉素100 mg/L的1640和DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基于37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合到85%左右時(shí),用0.25%胰酶消化,傳代［9］。

1.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔接種100μL,培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后,再分別加入miR-181a-5p、anti-miR-181a-5p,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置不受處理因素的對(duì)照組(NC),也設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入25μL的MTT噻唑藍(lán),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心棄去培養(yǎng)液,再每孔加入150μL的DMSO,于搖床上振搖10min,充分溶解生成的結(jié)晶,然后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組的光吸收值(OD值),重復(fù)3次,取均值。用下面的公式計(jì)算各組藥物的細(xì)胞的抑制率［10-11］:抑制率=(1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè):按照流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒操作,以適量的胰酶消化、收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌、重懸細(xì)胞,2 000 r/min,5min收集(1×105)～(5×105)個(gè)細(xì)胞,離心沉淀,加入500 uL Binding Buffer重懸細(xì)胞,向重懸液中加入5 uL Annexin V-FITC染色,隨后加入5 uL PI染色,室溫下避光孵育15m in,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 miR-181a-5p靶基因的鑒定:從A549細(xì)胞中提取總RNA,并反轉(zhuǎn)成cDNA后用來(lái)作為PCR的模板,成功的得到了5種靶基因的目的片段。經(jīng)割膠回收后,在37℃用相適應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切2 h后,用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜后,轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,送至上海英俊生物公司測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)無(wú)誤后,用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒提取重組質(zhì)粒。抽得重組質(zhì)粒,用限制性?xún)?nèi)切酶酶切驗(yàn)證。

1.3.5 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn):在顯微鏡載物臺(tái)上靜置細(xì)胞2.5 h,通過(guò)攝像頭、監(jiān)控儀、錄像機(jī)等設(shè)備記錄整個(gè)過(guò)程,然后通過(guò)圖像轉(zhuǎn)化和采集系統(tǒng)保存實(shí)驗(yàn)照片。用Imagine Tool和Image-Pro Plus 6.0測(cè)量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的幾何中心二維坐標(biāo),用Microsoft Excel2013XY散點(diǎn)圖繪制細(xì)胞遷移軌跡,時(shí)間間隔為5min,每張圖取5個(gè)細(xì)胞求平均數(shù)。

1.3.6 qRT-PCR分析基因表達(dá):A549細(xì)胞,對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-181a-5p,在mRNA水平檢測(cè)miR-181a-5p對(duì)靶基因的下調(diào)情況,靶基因里除了預(yù)測(cè)的基因,還包括文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道m(xù)iR-181a-5p明確的靶基因,如 BCL2L11［12-13］,但這些基因在非小細(xì)胞肺癌中并未驗(yàn)證,而是在其它癌癥中做過(guò)相關(guān)研究,引物來(lái)源于哈弗醫(yī)學(xué)院的引物庫(kù) (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)。

2 結(jié)果

2.1 miR-181a-5p抑制細(xì)胞增殖和克隆形成 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:上調(diào)miR-181a-5p會(huì)顯著抑制細(xì)胞株A549的增殖(圖1A),細(xì)胞用結(jié)晶紫染料染色。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p將近上調(diào)了40倍(圖1B)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后增殖能力低于轉(zhuǎn)染NC的對(duì)照組,而轉(zhuǎn)染antimiR-181a-5p的實(shí)驗(yàn)組對(duì)比NC增殖能力有所提升(圖1C、D)。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)中,對(duì)比NC,過(guò)表達(dá)miR-181a-5p抑制了細(xì)胞克隆的形成,細(xì)胞克隆的數(shù)量和大小均有顯著的差異(P＜0.05,圖1E,F),這幾個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了過(guò)表達(dá)miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞增殖具有抑制作用。

圖1 miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect ofmiR-181-a-5p on A549 cell proliferation

2.2 miR-181a-5p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 流式結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染miR-181a-5p 48h后早期凋亡提高了6.37%(見(jiàn)圖2)。說(shuō)明miR-181a-5p表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞的早期凋亡。

圖2 miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect ofmiR-181-a-5p on A549 cell apoptosis

2.3 過(guò)表達(dá)miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移的影響 細(xì)胞劃痕法結(jié)果表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后細(xì)胞遷移率顯著降低,只有大約18%,而細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-181a-5p后具有較高的運(yùn)動(dòng)水平,細(xì)胞遷移率接近45%(圖3A、3C)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組NC相對(duì)比,實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)Transwell小皿的細(xì)胞數(shù)量在轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后顯著減少,約為75個(gè)細(xì)胞(圖3B、3D)。表明轉(zhuǎn)染miR-181a-5p的A549細(xì)胞的遷移受到了顯著的抑制(P＜0.05)。

圖3 miR-181a-5p對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響Fig.3 Effect ofmiR-181-a-5p on themovement of A549 cell

2.4 miR-181a-5p靶基因的鑒定

2.4.1 PCR產(chǎn)物連接載體:載體酶切位點(diǎn)信息(見(jiàn)圖4),酶切后對(duì)比片段大小。

圖4 PGL3載體上酶切位點(diǎn)及相關(guān)信息Fig.4 PGL3 vector restriction sites and related information

2.4.2 雙熒光報(bào)告基因分析:重組載體與miR-181a-5p的mimics共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞48 h后,分別檢測(cè)各組海腎熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性,以轉(zhuǎn)入NC和重組質(zhì)粒的作為對(duì)照組。結(jié)果表明5種靶基因的3'-UTR均受到了miR-181a-5p的調(diào)控,其中以Kras和PLAG1受到的調(diào)控最為明顯,相比轉(zhuǎn)入NC的對(duì)照組顯著下降了50%左右,其中的Kras因?yàn)樵?'-UTR發(fā)現(xiàn)2個(gè)結(jié)合位點(diǎn),因此在克隆Kras時(shí)共克隆了3個(gè)載體,第一個(gè)載體含有miR-181a-5p的第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),第二個(gè)載體上的片段含miR-181a-5p的另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),第三個(gè)載體連上的片段包含有miR-181a-5p結(jié)合的2個(gè)位點(diǎn)(見(jiàn)圖5)。從結(jié)果可以看出這些基因的3'-UTR受到miR-181a-5p的調(diào)控,而Kras基因的2個(gè)位點(diǎn)都有不同程度的下調(diào),同時(shí)包含有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的載體比其中任何一個(gè)都較為明顯,推測(cè)這2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都是有效的。

圖5 miR-181a-5p與其可能的靶基因的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 miR-181a-5p過(guò)表達(dá)對(duì)靶基因mRNA水平的影響

2.4.3 qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后基因下調(diào)情況:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在這些靶基因中Kras的mRNA下調(diào)情況最為顯著(圖6A),而原先在乳腺癌中報(bào)道的BCL2L11為miR-181a-5p的靶基因,在非小細(xì)胞肺癌中得到相反的結(jié)果,靶基因在mRNA水平反而上調(diào)了。因此,推測(cè)miR-181a-5p或BCL2L11所扮演的角色具有組織或者細(xì)胞特異性。即不同的基因在不同的組織或細(xì)胞中調(diào)控的通路或者網(wǎng)絡(luò)存在差異性。

對(duì)照組轉(zhuǎn)染NC,結(jié)果顯示:和對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的許多抑癌基因表達(dá)量有所上調(diào),一些促進(jìn)凋亡的基因表達(dá)量相對(duì)升高如(圖6B);miR-379,miR-30a,miR-126-3p,有顯著的下調(diào),而在其它癌癥中比較明確發(fā)揮抑癌功能的miR-34a的表達(dá)量顯著上調(diào),這進(jìn)一步證明了miR-181a-5p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,以及在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因的功能。

圖7 miR-181a-5p通過(guò)靶向結(jié)合3'-UTR下調(diào)Kras的表達(dá)Fig.7 Expression ofmiR-181a-5p in Kras to combine 3'-UTR through the target

2.4.4 miR-181a-5p靶基因的驗(yàn)證:為了驗(yàn)證miR-181a-5p可以直接作用于Kras的3′-UTR,調(diào)控其在mRNA和蛋白水平的表達(dá),并明確結(jié)合位點(diǎn),實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建好的PGL3載體為模版,做載體突變實(shí)驗(yàn),將載體上的miR-181a-5p的結(jié)合位點(diǎn)TGAATGT突變成CGGACGC如(圖7A)所示,突變后的位點(diǎn)經(jīng)轉(zhuǎn)錄后將不能和miR-181a-5p結(jié)合。突變采用傳統(tǒng)的引物隔花突變,隔一個(gè)堿基做一個(gè)突變,突變采用高保真酶進(jìn)行,PCR后的產(chǎn)物因?yàn)橛性瓉?lái)大抽的載體,即實(shí)驗(yàn)中作為模版的載體和PCR的突變產(chǎn)物載體,因此需要去除原來(lái)未突變的載體。大抽的載體因?yàn)樵诰w里有經(jīng)過(guò)甲基化,而PCR的突變載體沒(méi)有甲基化,所以我們可以在整個(gè)產(chǎn)物中加入甲基化酶來(lái)破壞原有的模版載體,再進(jìn)行轉(zhuǎn)化和測(cè)序,并進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果如圖7B所示。然而,內(nèi)源的Kras在蛋白水平是否受到miR-181a-5p的調(diào)控?如圖7C所示,轉(zhuǎn)染miR-181a-5p的實(shí)驗(yàn)組 Kras的蛋白水平下調(diào)了將近75%,而轉(zhuǎn)染anti-miR-181a-5p的實(shí)驗(yàn)組和NC相比也有顯著的區(qū)別。因此,本實(shí)驗(yàn)證明了miR-181a-5p可以在mRNA和蛋白水平對(duì)靶基因Kras進(jìn)行調(diào)控。

2.4.5 DNA甲基化對(duì)miR-181a-5p表達(dá)的影響:采用甲基化酶抑制劑處理A549細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p的轉(zhuǎn)錄水平顯著提升(見(jiàn)圖8),推測(cè)未加甲基化酶抑制劑的對(duì)照組受到甲基化酶的調(diào)控,影響miR-181a-5p的表達(dá),而Kras作為 miR-181a-5p靶向調(diào)控的基因,在miR-181a-5p表達(dá)水平上升時(shí)發(fā)生下調(diào)也是合理的。

圖8 加入甲基化酶抑制劑后miR-181a-5p和Kras的表達(dá)Fig.8 Expression ofmiR-181a-5p and Kras after added methylation enzyme inhibitor

3 討論

本研究證明了miR-181a-5p和Kras存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系,miR-181a-5p在A549細(xì)胞株中發(fā)揮抑癌基因的功能,在病例樣本中,病人的年齡以及癌癥的惡性程度越高,相應(yīng)的miR-181a-5p表達(dá)量比較低。而Kras則隨年齡和惡性程度的升高而表達(dá)量上升。細(xì)胞株中miR-181a-5p的表達(dá)量普遍顯著下調(diào)。之前報(bào)道［14-15］的乳腺癌中miR-181a可以下調(diào)BCL2L11并發(fā)揮抑癌基因的功能,但在A549中過(guò)表達(dá)miR-181a-5p后BCL2L11卻出現(xiàn)上升的情況,因此推測(cè)基因具有組織或細(xì)胞特異性。細(xì)胞癌化到一定階段往往具有遷移性,從而導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散。起抑癌作用的miRNA可能通過(guò)調(diào)控一些基因,影響細(xì)胞的遷移,細(xì)胞遷移也是癌癥進(jìn)程的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用兩種相類(lèi)似的方法共同驗(yàn)證miR-181a-5p對(duì)細(xì)胞遷移的影響。此外,miR-181a-5p對(duì)其它miRNA也有調(diào)控作用,miR-34a在轉(zhuǎn)染miR-181a-5p后有顯著的上調(diào)。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)暗示了miR-181a-5p在非小細(xì)胞肺癌中能影響多樣的細(xì)胞進(jìn)程,通過(guò)靶向基因調(diào)控發(fā)揮作用。

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,選擇性地添加甲基到DNA的CG兩個(gè)核苷酸,形成5-甲基胞嘧啶?；虻膯?dòng)子區(qū)CpG島在正常情況下一般是非甲基化的,當(dāng)發(fā)生甲基化時(shí),時(shí)常發(fā)生基因的轉(zhuǎn)錄沉寂,使一些抑癌基因喪失功能,從而導(dǎo)致正常的細(xì)胞調(diào)控失常,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR-181a-5受到甲基化調(diào)控。

腫瘤的治療還需要解決一些技術(shù)問(wèn)題,需要選擇合適的給藥載體和給藥方式使藥物可以準(zhǔn)確地送達(dá)病灶。除了技術(shù)問(wèn)題我們還應(yīng)順著調(diào)控網(wǎng)絡(luò)追溯到源頭,鑒定miRNA的啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,相信隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展,這些機(jī)制將會(huì)向我們揭開(kāi)神秘面紗,使miRNA應(yīng)用到各類(lèi)疾病的應(yīng)用和治療中。

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(編校:吳茜)

Analysis ofm iR-181a-5p function in non-small cell lung cancer

WANG Ying1,GUO Ren-hua2

(1.Department of Internal Medicine-Oncology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan 453100,China;2.Department of Internal Medicine-Oncology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective The aims of this study were to explore the biologic functions ofmiR-181a-5p in NSCLC and investigate whether it can be a marker for detecting NSCLC.Methods A549 cell growth and apoptosis after transfected miR-181a-5p were examined by CCK8 and flow cytometry,respectively,themovement of A549 cell were detected by Transwell assay and wound healing assay.Interaction ofmiR-181a-5p and its possible target genes were detected by dual luciferase reporter assay.Results MiR-181a-5p inhibited A549 cell proliferation,promoted cell apoptosis in vitro.Transwell assay and wound healing assay showed thatmiR-181-5p negatively regulated cellmigration in vitro.MiR-181a-5p down-regulated Kras expression by directly targeting its 3′-UTR.Kraswas inversely correlated withmiR-181a-5p expression in NSCLC.Conclusion MiR-181a-5p might provide a potential treatment approach for NSCLC patients.

miR-181a-5p;proliferation;migration;apoptosis;non small cell lung cancer

R655

A

1005-1678（2014)06-0006-05

2011年國(guó)家自然科學(xué)基金(81172217)

王穎，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療，E-mail：qch1821460017@163.com。