付曉磊，趙春暉，崔洪光，楊君微，張翼軒，趙龍鉉,,*

（1. 遼寧師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116029；2. 遼寧師范大學(xué) 生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116029；3. 大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622）

0 引言

哌嗪環(huán)是藥物研發(fā)中常用的堿性基團(tuán)，易形成氫鍵或離子鍵，能有效調(diào)節(jié)藥物的脂水分配系數(shù)和酸堿平衡常數(shù)，將其引入分子，能有效地增加分子的堿性和水溶性，進(jìn)而顯示出更好的生物活性[1]。由于取代基的基團(tuán)、位置及連接方式的不同，哌嗪類化合物顯示出了廣泛的藥理活性[2]，如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、治療阿爾茨海默病等[3-6]。在合成藥物方面，主要有吡酮酸(俗稱喹諾酮)類抗生素[7]，利福霉素類抗生素[8]，驅(qū)腸蟲藥等[9]。

氨基酸具有良好的生物相容性和親和性，無免疫源性，對(duì)人體無不良反應(yīng)。將其引入藥物分子進(jìn)行偶聯(lián)，不但可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的吸收，增強(qiáng)藥物的溶解度，而且有利于降低藥物的毒性。Ruchi[10]等通過哌嗪雙取代物與O,O-二乙基氯代磷酸鹽反應(yīng)得到相應(yīng)的哌嗪雙取代衍生物，其中的 1,4-二(4-氯苯烯基)哌嗪二縮氨基硫脲和 1,4-二(4-甲基苯烯基)哌嗪二縮氨基硫脲有明顯的抗真菌活性。Robert[11]等研究發(fā)現(xiàn)，一些哌嗪的雙取代醇類、酮類、烷基類化合物對(duì)瘧疾有顯著的抑制作用。胡國強(qiáng)等[12]設(shè)計(jì)并合成了一系列的雙取代哌嗪衍生物，發(fā)現(xiàn)其有良好的抗菌活性。

因此，根據(jù)藥物設(shè)計(jì)原理中的拼合原理，我們設(shè)計(jì)合成了一系列哌嗪的氨基酸雙取代化合物，然后對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了野生型大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌活性測試。合成路線如圖1所示。

圖1 哌嗪的氨基酸綴合物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

WGH-30雙光束紅外分光光度計(jì)，KBr壓片；BRUKER-500MHz核磁共振儀，CDCl3為溶劑；X-5顯微熔點(diǎn)測定儀(控溫型)，溫度未經(jīng)校正；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀。所用的試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

菌種：野生型大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 PP-1a的合成和表征

在 100 mL圓底燒瓶中，將 PP(50 mg， 0.58 mmol)、Boc-Phe-OH(327 mg, 1.28 mmol)、DMAP(142 mg， 1.16 mmol)的 CH2Cl2(7 mL)溶液液冷卻到 0℃，把 EDCI(223 mg，1.16 mmol)的 CH2Cl2(3 mL)溶液在攪拌下逐滴加入反應(yīng)瓶中，滴加完畢后再在0℃條件下攪拌5 min，室溫下攪拌5 h，反應(yīng)完畢后，用水和CH2Cl2對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行萃取，并用飽和NaCl溶液洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑得粗產(chǎn)品，再用乙酸乙酯/石油醚(3:2, V:V)作洗脫劑進(jìn)行加壓柱層析，分離得白色固體PP-1a: 1,4-雙-(N-叔丁氧羰基苯丙氨?；?哌嗪。產(chǎn)量：236 mg，產(chǎn)率：70%，熔點(diǎn)：215.2～217.7 ℃; IR(KBr): 3445,3275, 2969, 1701, 1631, 1536, 1442, 1297, 1223, 1162 cm-1;1H NMR (500MHz, CDCl3):δ7.29-7.15(m, 10H,10×Ph-H), 5.34-5.31(m, 2H, 2×-NH-), 4.78-4.73(m, 1H,-COCHNH-), 4.69-4.64(m, 1H, -COCHNH-), 3.55(d,J=10.3 Hz 1H, piperazine CH), 3.29(brs, 1H, piperazine CH), 3.19(brs, 1H, piperazine CH), 3.10(d,J=9.7 Hz 1H, piperazine CH), 3.01-2.96(m, 2H, piperazine CH2),2.90-2.85(m, 2H, Ph-CH2-), 2.74-2.73(m, 2H,piperazine CH2), 1.46(s, 9H, (CH3)3CO-), 1.45(s, 9H,(CH3)3CO-)。

1.3 PP-1b的合成和表征

按照合成PP-1a的實(shí)驗(yàn)方法由化合物PP(50 mg，0.58 mmol)和 Boc-Val-OH(278 mg，1.28 mmol)反應(yīng)得到了白色固體PP-1b: 1,4-雙-(N-叔丁氧羰基纈氨?；?哌嗪。產(chǎn)量：234 mg，產(chǎn)率：83.2%，熔點(diǎn)：>300℃;IR(KBr): 3438, 3323, 2975, 1701, 1638, 1516, 1442,1237, 1169 cm-1;1H NMR(500 MHz, CDCl3):δ5.25(d,J=9.2 Hz, 2H, 2×-NH-), 4.42(d,J=5.8 Hz, 2H,2×-COCH NH-), 3.89-3.37(m, 8H, 4×piperazine CH2),1.96-1.90(m, 2H, 2×(CH3)2CH-), 1.44(s, 18H, 2×(CH3)3CO-), 0.95(d,J=6.1Hz, 6H, (CH3)2CH-), 0.90(d,J=6.8Hz, 6H, (CH3)2CH-)。

1.4 PP-1c的合成和表征

按照合成PP-1a的實(shí)驗(yàn)方法由化合物PP(50 mg，0.58 mmol)和 Boc-D-Phg-OH(322 mg，1.28 mmol)反應(yīng)得到了白色固體PP-1c: 1,4-雙-(N-叔丁氧羰基苯甘氨?；?哌嗪。產(chǎn)量：240 mg，產(chǎn)率：75%，熔點(diǎn)：115.3～117.9 ℃; IR(KBr): 3426, 3305, 2915, 1712,1550, 1436, 1285, 1249, 1120 cm-1;1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.34-7.30(m, 10H, 10×Ph-H), 5.90(d,J=6.5 Hz 2H, 2×Ph-CH-NH-), 5.52(d,J=6.5 Hz 1H, Ph-CHNH-), 5.38(d,J=6.5 Hz 1H, Ph-CH-NH-), 3.99(d,J=9.8 Hz 1H, piperazine CH), 3.54(brs, 1H, piperazine CH),3.43(brs, 1H, piperazine CH), 3.17-3.13(m, 4H,2×piperazine CH2), 2.56(d,J=9.8 Hz 1H, piperazine CH), 1.39(s, 18H, 2×(CH3)3CO-)。

1.5 PP-1d的合成和表征

按照合成PP-1a的實(shí)驗(yàn)方法由化合物PP(50 mg，0.58 mmol)和 Boc-PDC(380 mg，1.28 mmol)反應(yīng)得到了白色固體PP-1d: 1,4-雙-(N-叔丁氧羰基苯硫丙氨酰基)哌嗪。產(chǎn)量：340 mg，產(chǎn)率：90.9%，熔點(diǎn)：57.1～59.9 ℃; IR(KBr): 3445, 3298, 2945, 1706, 1649,1576, 1474, 1260, 1115 cm-1;1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ7.40-7.20(m, 10H, 10×Ph-H), 5.39-5.36(m,2H, 2×-NH-), 4.78-4.74(m, 2H, 2×-CH-NH-), 3.47-3.13(m, 12H, 2×-S-CH2- and 4×piperazine CH2), 1.44(s,9H, (CH3)3CO-), 1.43(s, 9H, (CH3)3CO-)。

1.6 PP-2a的合成和表征

在冰浴攪拌條件下，將 TFA(0.38 mL)逐滴加入到 PP-1a(100 mg，0.17 mmol)的 CH2Cl2(3 mL)溶液中，室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后，減壓蒸餾除去溶劑，剩余液體用氨水調(diào)節(jié)pH至堿性，用水和CH2Cl2對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行萃取，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑得粗產(chǎn)品，再用甲醇/二氯甲烷(1:10, V:V)作洗脫劑進(jìn)行加壓柱層析，分離得白色固體PP-2a: 1,4-雙-(苯丙氨?；?哌嗪。產(chǎn)量：52 mg，產(chǎn)率：80%，熔點(diǎn)：112.5～113.4℃; IR(KBr): 3525, 3393,2948, 1715, 1540, 1430, 1268, 1156 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6):δ7.28-7.15(m, 10H, 2×Ph-), 3.92-3.88(m, 2H, 2×NH2-CH-), 3.44-3.13(m, 8H, 4×piperazine CH2), 3.05-2.94(m, 4H, 2×Ph-CH2-), 2.80-2.69(m, 4H, 2×NH2-)。

1.7 PP-2b的合成和表征

按照合成PP-2a的實(shí)驗(yàn)方法由化合物PP-1b(100 mg， 0.21 mmol)反應(yīng)得到了白色固體PP-2b: 1,4-雙-(纈氨?；?哌嗪。產(chǎn)量：50 mg，產(chǎn)率：84.7%，熔點(diǎn)：110.2～112.0 ℃; IR(KBr): 3526, 3331, 2950, 1685,1237, 1146cm-1;1H NMR(400MHz, CDCl3):δ3.82-3.46(m, 10H, 2×-COCHNH2, 4×piperazine CH2), 1.92-1.84(m, 2H, 2×(CH3)2CH-), 1.29(brs, 2H, 2×NH2-),1.00(d,J=6.8Hz, 6H, (CH3)2CH-), 0.93(d,J=6.4Hz, 6H,(CH3)2CH-)。

1.8 PP-2c的合成和表征

按照合成PP-2a的實(shí)驗(yàn)方法由化合物PP-1c(100 mg，0.21 mmol)反應(yīng)得到了白色固體PP-2c: 1,4-雙-(苯甘氨?；?哌嗪。產(chǎn)量：51 mg，產(chǎn)率：80.6%，熔點(diǎn)：104.7～106.7 ℃; IR(KBr): 3513, 3343, 2926, 1638,1515, 1448, 1223, 1189 cm-1;1HNMR (400 MHz,CD3OD):δ7.39-7.34(m, 10H, 10×Ph-H), 4.98-4.80(m,2H, 2×Ph-CH-), 3.75(d,J=12.0 Hz 1H, piperazine CH),3.53-3.48(m, 2H, piperazine CH2), 3.37-3.35(m, 1H,piperazine CH), 3.20-3.13(m, 2H, piperazine CH2),3.06-3.03(m, 1H, piperazine CH), 2.84(d,J=12.0 Hz 1H,piperazine CH)。

1.9 PP-2d的合成和表征

按照合成PP-2a的實(shí)驗(yàn)方法由化合物PP-1d(150 mg， 0.23 mmol)反應(yīng)得到了白色油狀固體 PP-2d:1,4-雙-(苯硫丙氨酰基)哌嗪。產(chǎn)量：72 mg，產(chǎn)率：70.5%; IR(KBr): 3580, 3364, 2903, 1713, 1524, 1496,1256, 1102 cm-1;1HNMR(500 MHz, DMSO-d6):δ7.36-7.17(m, 10H, 10×Ph-H), 3.79(brs, 2H, 2×NH2-CH-), 3.48-3.34(m, 8H, 4×piperazine CH2), 3.16(dd,J=13.3 Hz, 7.2Hz, 2H, Ph-S-CH2-), 3.02(dd,J=13.3 Hz,7.2 Hz, 2H, Ph-S-CH2-), 2.01(brs, 4H, 2×NH2-)。

2 哌嗪的氨基酸綴合物的抑菌活性測試

2.1 菌種培養(yǎng)

分別取3 L的野生型大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接種于兩支含有3 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，過夜活化。取活化后的菌液各5 L，分別加入兩支含有5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，搖2 h20 min，使用血球計(jì)數(shù)板記錄兩種菌數(shù)，用LB液體培養(yǎng)基稀釋到1×106CFU/mL備用。

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

(1) 化合物的配制：將化合物用 DMSO 溶解為10 mg/mL，再用LB液體培養(yǎng)基稀釋成為1.5 mg/mL。

(2) TTC的稱?。嚎焖俜Q取TTC于棕色試劑瓶中，用ddH2O溶解為4%濃度的溶液，使用0.22 L的濾膜濾菌，再用無菌LB液體培養(yǎng)基稀釋成0.5%的溶液(避光保存)。

(3) 抗菌實(shí)驗(yàn)：取出96孔板，向第B-G行均加入50 L LB液體培養(yǎng)基；向A、B行加50 L化合物，每種化合物兩個(gè)平行；用排槍從 B-G行梯度稀釋，使得A-G的濃度依次為0.75 mg/mL，0.375 mg/mL，0.188 mg/mL，0.094 mg/mL，0.047 mg/mL，0.023 mg/mL，0.012 mg/mL。向所有孔中加入 50 L菌液(1×106CFU/mL )，混勻后每孔加入10 L 0.5%TTC；其中需做Amp陽性對(duì)照及不加抗菌肽的陰性對(duì)照。

(4) 過夜孵育：將加完樣的 96孔板放于酶標(biāo)儀上震動(dòng)1 min，使各孔溶液混勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育14 h。用肉眼觀察孔內(nèi)顏色變化（有菌生長則呈現(xiàn)紅色，無菌生長則無顏色變化），并使用酶標(biāo)儀在OD492時(shí)測量MIC值。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

我們通過對(duì)所合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行抑菌活性測試，得到化合物在濃度范圍0.012～0.75 mg/mL時(shí)對(duì)E. coli和S. a的抑制作用曲線，如圖2、圖3所示。根據(jù)抑菌作用曲線，總結(jié) 8個(gè)哌嗪氨基酸綴合物對(duì)E. coli和S. a的抑菌效果，如表1所示。

圖2 化合物在濃度范圍0.012-0.75時(shí)對(duì)E. coli的抑制作用

表1 化合物在濃度范圍0.012～0.75 mg/mL時(shí)對(duì)E. coli、S. a的抑制作用

3 結(jié)果與討論

我們做了以下工作：(1)首先以哌嗪為起始原料，在哌嗪N-1和N-4位導(dǎo)入氨基被保護(hù)的氨基酸，（2）在CH2Cl2溶劑中、在TFA作用下，打掉氨基的Boc保護(hù)基，得到8個(gè)哌嗪的氨基酸綴合物。

從以上圖、表中可以看出，化合物PP-1b、PP-2a、PP-1c、PP-2c、PP-2d對(duì)E. coli具有抑菌效果，并且抑菌作用隨化合物濃度的升高而增強(qiáng)；PP-1a在0.4～0.8 mg/mL具有抑菌效果，作用效果較弱；PP-2b、PP-1d在0.65～0.8 mg/mL具有抑菌效果，作用效果較弱?；衔?PP-1a、PP-2a、PP-1b、PP-2b、PP-1c、PP-2c、PP-2d對(duì)S. a具有一定的抑菌效果并且抑菌作用隨化合物濃度的升高增強(qiáng)；PP-1d在 0.012～0.75 mg/mL濃度間不具有抑菌效果。

4 結(jié)論

本文以哌嗪為起始原料，在DMAP為催化劑、EDCI為脫水劑條件下，與一系列氨基被保護(hù)的氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)，再在三氟乙酸條件下脫去Boc保護(hù)基，共設(shè)計(jì)合成了8種未見報(bào)道的哌嗪氨基酸綴合物，利用IR和1H NMR波譜技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。然后對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了野生型大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌活性測試。結(jié)果表明化合物 PP-1a、PP-2a、PP-1b、PP-2b、PP-1c、PP-2c、PP-2d對(duì)Staphylococcus aureus具有一定的抑菌效果并且抑菌作用隨化合物濃度的升高增強(qiáng)。

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