肖軍蘭 曾金林 湛曦 余燕琪

臨床治療食管癌方法較多，但比較傳統(tǒng)，未顯著改善患者的5年生存率[1-3]。本文回顧性分析2012年1月-2014年1月在本院接受治療的70例食管癌患者，收集其臨床資料、癌組織及癌周圍正常組織的標(biāo)本等資料，并分析干細(xì)胞Nanog蛋白在食管癌組織中的表達(dá)及其意義?，F(xiàn)將情況報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月-2014年1月在本院接受治療的食管癌患者70例，收集其臨床資料、癌組織及癌周圍正常組織的標(biāo)本等資料。所有患者均符合食管癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均初發(fā)，手術(shù)前未接受化療及放療。其中男41例，女29例，年齡44~81歲，平均（62.65±5.24）歲。按照WHO組織學(xué)分型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將其分為19例高分化，26例中分化，25例低分化；39例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，31例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期42例。

1.2 方法

1.2.1 采集標(biāo)本 選擇70例食管癌患者癌細(xì)胞組織標(biāo)本、與癌組織邊緣距離大于5 cm的癌周圍組織標(biāo)本。將兩組標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。食管癌細(xì)胞系Eca-109及TE-1均采自細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2 食管癌組織Nanog蛋白檢測(cè) 采用免疫組化PV二步法，用Nanog陽(yáng)性蛋白染色精原細(xì)胞瘤進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，使用PBS進(jìn)行陰性對(duì)照[4]。具體操作方法如下：先進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，使檸檬酸抗原微波修復(fù)之后，逐漸冷卻；再分別滴加一抗和二抗孵育。其中一抗要用1：400稀釋，二抗要用1：100稀釋。待DAB顯色之后，依次進(jìn)行脫水、透明及封片。之后在高倍鏡輔助下，選擇不同視野，分別計(jì)數(shù)癌細(xì)胞200個(gè)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占數(shù)量計(jì)算百分比：強(qiáng)陽(yáng)性，即陽(yáng)性細(xì)胞大于50%，為棕褐色；中度陽(yáng)性，即陽(yáng)性細(xì)胞在30~50%之間，為棕黃色；弱陽(yáng)性，即陽(yáng)性細(xì)胞低于30%，為淺黃色；陰性，即沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.3 食管癌細(xì)胞系Eca-109及TE-1檢測(cè) 應(yīng)用免疫熒光技術(shù)[5]。具體措施為：將食道癌細(xì)胞置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，細(xì)胞在5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%融合時(shí)再傳代。胰酶消化完畢后要搖均勻，接種后用5% CO2孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，并用4%多聚甲醛固定牢固，其中一抗孵育過(guò)夜，二抗避光孵育2 h，再避光復(fù)染15 min。用PBS清洗后，進(jìn)行熒光照相，利用高倍鏡觀察，隨機(jī)選擇12~18個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中核表達(dá)陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量，從而準(zhǔn)確計(jì)算核表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織Nanog蛋白表達(dá) 癌周圍正常組織Nanog蛋白主要呈現(xiàn)低水平表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)主要存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部；食管癌組織中的Nanog蛋白表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，顏色為棕黃色，呈顆粒狀，陽(yáng)性率與組織惡性程度呈正比，即組織惡性程度越高，陽(yáng)性率越高，Nanog蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)逐漸增多，尤其是在低分化細(xì)胞核中，其Nanog蛋白陽(yáng)性率高達(dá)45.7%（32/70），癌周圍正常組織僅為12.86%（9/70）。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 食管癌組織Nanog蛋白表達(dá)和臨床病理的關(guān)系 食管癌組織中的Nanog蛋白表達(dá)水平和食管癌病理分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 食管癌組織Nanog蛋白表達(dá)和臨床病理的關(guān)系

2.3 食管癌細(xì)胞系Nanog蛋白表達(dá) 食管癌細(xì)胞系Eca-109及TE-1的Nanog陽(yáng)性蛋白表達(dá)水平較高，存在異質(zhì)性，多數(shù)細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主，少數(shù)則以細(xì)胞核表達(dá)為主，且細(xì)胞核表達(dá)陽(yáng)性率為10%。

3 討論

Nanog是胚胎干細(xì)胞中參與干細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，它作為維持干細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因、干細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志，引起醫(yī)學(xué)專家的很大重視[5-7]。有研究結(jié)果認(rèn)為，Nanog蛋白在體細(xì)胞腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤中，均有表達(dá)，且對(duì)腫瘤的治療、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后等產(chǎn)生重要影響[8]。經(jīng)分析，Nanog蛋白過(guò)表達(dá)或許是時(shí)腫瘤組織產(chǎn)生耐藥性的重要原因[9]。本次研究，通過(guò)檢測(cè)Nanog蛋白在食管癌組織及癌周組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明Nanog蛋白在正常組織中的少量表達(dá)主要集中在食管黏膜基底層細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，原因可能是基底層細(xì)胞具備干細(xì)胞的特點(diǎn)，屬于增生層，而Nanog蛋白能夠控制細(xì)胞增殖活動(dòng)。食管癌組織Nanog蛋白呈高水平表達(dá)，其陽(yáng)性率與組織惡性程度呈正比，病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加、腫瘤分化程度降低，Nanog蛋白表達(dá)便會(huì)升高[10]。

大部分細(xì)胞Nanog蛋白表達(dá)主要集中在細(xì)胞質(zhì)，少許在細(xì)胞核表達(dá)[11-13]。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，食管癌細(xì)胞系Eca-109及TE-1的Nanog陽(yáng)性蛋白表達(dá)水平較高，以細(xì)胞質(zhì)為主，含少量細(xì)胞核，說(shuō)明腫瘤干細(xì)胞含有少量以核表達(dá)為主的細(xì)胞。

綜上所述，干細(xì)胞Nanog蛋白在食管癌組織中的表達(dá)水平，和食管癌病變的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移情況有密切關(guān)系。

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