崔立然 李洪軍 王宏艷 劉穎 徐浩 胡靈佳 許惠玉

碳水化合物中的糖類化合物是自然界存在較多并具有重要生物功能的一類化合物。中藥多糖特別是補(bǔ)益類中藥多糖一般都有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，能激活T細(xì)胞向Th1和Th1型方向分化、促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體、激活巨噬細(xì)胞（MФ）的吞噬能力、自然殺傷細(xì)胞（NK）、細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）等免疫細(xì)胞的功能，還能活化補(bǔ)體，促進(jìn)免疫細(xì)胞因子的生成。中藥多糖在多方面對免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，對正常細(xì)胞沒有毒副作用，而其多聚體多糖結(jié)構(gòu)能克服鋁佐劑所形成的慢性免疫激活誘導(dǎo)毒性的可能性，很有希望開發(fā)成為新型疫苗佐劑[1]。姬松茸（Agaricus Blazei Murrill，ABM）原產(chǎn)于巴西，又稱巴西蘑菇，屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱 、傘菌目、傘菌科、傘菌屬。該菌不僅味道鮮美，營養(yǎng)豐富，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、核酸、醇類等活性成分及人體必需的多種氨基酸等成分[2]；尤其在增加機(jī)體免疫力、抗腫瘤防癌、降血脂、改善動脈硬化、防治糖尿病和增強(qiáng)人體免疫力等功效方面效果奇特[3-6]。課題組從姬松茸提取多糖（ABP-AW1），探討ABP-AW1促進(jìn)OVA抗原誘導(dǎo)Th1/Th2免疫反應(yīng)的研究，旨在尋找具有不同于鋁的Th1優(yōu)勢反應(yīng)的佐劑。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 姬松茸多糖ABP-AW1由本實驗室提取分離鑒定。最終確定其為組分均一的低分子量（50 KDa）多糖；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG2b，IgG1抗體（SBA公司）；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體（中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.2 動物免疫 ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為六組，每組15只。分別為PBS免疫組、OVA免疫組（OVA 100μg/只 ）、Alum 免 疫 組（OVA 100μg/只 +Alum 200μg/只）、DT1劑量免疫組（ABP-AW1 200μg/只+OVA 100μg/只）、DT2劑量免疫組（ABP-AW1 100μg/只+OVA 100μg/只）、DT3劑量免疫組（ABPAW1 50μg/只+OVA 100μg/只）。各組分別于第1天和第15天背部皮下兩點注射免疫小鼠，二免后14 d取抗凝血，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取脾進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3 免疫小鼠血清中抗OVA特異性抗體強(qiáng)度的測定

1.3.1 抗血清的收集 二次免疫后14 d摘除眼球采集各組小鼠血液，將血液存于1.5 mL離心管中，室溫存放2 h，超速離心機(jī)離心，4 ℃，3000 rpm，10 min。微量移液器取分離血清，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 血清中抗OVA特異性抗體IgG的測定 于96孔酶標(biāo)板上，每孔加入100 μL包被液（含50 μg/mL OVA的0.05 M，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液），置37 ℃孵育1 h，用洗滌緩沖液PBST洗滌（重復(fù)3次，每次間隔20 s）。洗滌后每孔加封閉液200 μL，于37 ℃孵育1 h，洗滌3次，然后加1：200稀釋倍數(shù)的待測血清100 μL，重復(fù)3孔，37 ℃孵育1 h，洗滌3次。每孔加1∶800的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體稀釋液100 μL，37 ℃孵育0.5 h，洗滌6次。每孔分別加入100 μL TMB底物顯色液，37 ℃孵育15 min，每孔加終止液（2MH2SO4）50 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定OD值。

1.3.3 血清中抗OVA特異性抗體IgG亞類的測定 于96孔酶標(biāo)板上，每孔加入100 μL包被液（含50 μg/mL OVA的0.05 M，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液），置37 ℃孵育1 h，用洗滌緩沖液PBST洗滌（重復(fù)3次，每次間隔20 s）。洗滌后每孔加封閉液200 μL，于37 ℃孵育1 h，棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體洗滌3次，然后加1∶20稀釋倍數(shù)的待測血清100 μL，重復(fù)3孔，37 ℃孵育1 h，洗滌3次。每孔加1∶5000的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠（IgG1或IgG2b）抗體稀釋液100 μL，37 ℃孵育0.5 h，洗滌6次。每孔分別加入100 μ LTMB底物顯色液，37 ℃孵育15 min，每孔加終止液（2MH2SO4）50 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定OD值。

1.4 佐劑對小鼠的安全性評價 二免后14 d取眼球放血處死后，用10%甲醛固定免疫鼠心、肝、脾、肺、腎和腸，HE染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清中抗OVA特異性抗體IgG、IgG1、IgG2b含量分析 OVA免疫組血清中抗OVA特異性抗體IgG的產(chǎn)生與PBS免疫組、DT免疫組2、Alum免疫組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；OVA免疫組血清中抗OVA特異性抗體IgG2b的產(chǎn)生與PBS免疫組、DT免疫組2、DT免疫組3比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；OVA免疫組血清中抗OVA特異性抗體IgG1的產(chǎn)生與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表 1。

2.2 ABP-AW1對OVA受免小鼠免疫器官的影響 結(jié)果：二免后14 d經(jīng)病理學(xué)觀察，所有免疫小鼠未發(fā)現(xiàn)主要臟器腸、肝、脾、心、肺、腎等病理損傷及巨噬細(xì)胞滲入造成器官的損害。同時也觀察到佐劑接種后2 d內(nèi)，小鼠體重出現(xiàn)下降與對照組小鼠無明顯差異，但2 d后小鼠體重逐漸恢復(fù)正常。

表1 免疫小鼠抗血清中抗OVA特異性抗體IgG、IgG1、IgG2b含量分析（±s）

表1 免疫小鼠抗血清中抗OVA特異性抗體IgG、IgG1、IgG2b含量分析（±s）

*與OVA組比較，P<0.05

組別 IgG IgG2b IgG1 PBS免疫組（n=15） 0.94±0.10* 0.090±0.027* 0.33±0.07*OVA免疫組（n=15） 1.65±0.25 0.26±0.07 1.01±0.24 DT 免疫組1（n=15） 1.97±0.16 0.45±0.09 2.26±0.26*DT免疫組2（n=15） 2.08±0.25* 0.64±0.13* 2.97±0.22*DT免疫組3（n=15） 1.84±0.19 0.55±0.14* 1.86±0.18*Alum免疫組（n=15） 2.16±0.20* 0.32±0.09 3.50±0.47*

3 討論

目前，疫苗佐劑主要以1926年發(fā)現(xiàn)的鋁佐劑為主，國外幾種新型佐劑僅批準(zhǔn)在局部地區(qū)用于特定疫苗生產(chǎn)，如MF59佐劑在歐洲批準(zhǔn)用于流感等疫苗[7]。然而目前使用的免疫佐劑主要刺激Th2類型的免疫應(yīng)答。這種應(yīng)答對需要Th1免疫應(yīng)答的病毒和抗胞內(nèi)寄生菌感染和癌細(xì)胞無作用。另外，疫苗研究已趨向基因疫苗和亞單位化的研制，傳統(tǒng)的氫氧化鋁佐劑和油乳佐劑由于其自身的缺陷很難適應(yīng)新型疫苗的開發(fā)難以顯著提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平并適應(yīng)新型疫苗的開發(fā)[8]。免疫佐劑種類決定免疫應(yīng)答反應(yīng)的類型，不同免疫應(yīng)答反應(yīng)類型對疫苗的免疫保護(hù)性有顯著的影響[9]。因此，解決目前上述現(xiàn)實問題的重要途徑是研制新型的人用疫苗佐劑，這也成為當(dāng)今免疫學(xué)和化學(xué)界的一個活躍的領(lǐng)域。

淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中主要是由T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的核心，可分別通過介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫執(zhí)行特異性免疫應(yīng)答。姬松茸多糖其所含成分多糖具有廣泛的生物活性。課題組提取的低分子量（50 KDa）姬松茸多糖（ABP-AW1）先前的研究表明ABP-AW1免疫刺激活性效果顯著，為了進(jìn)一步研究ABP-AW1的佐劑生物活性，實驗中筆者研究與免疫功能密切相關(guān)的免疫球蛋白表達(dá)的改變，這些IgG的種類和數(shù)量決定Th細(xì)胞活化后是向Th1還是向Th2方向分化，并最終影響免疫應(yīng)答類型。

機(jī)體體液免疫中最關(guān)鍵的免疫細(xì)胞-B細(xì)胞通過分泌抗體，在體液免疫系統(tǒng)中發(fā)揮“指揮家”的作用，它們擔(dān)負(fù)著識別外來抗原的任務(wù)，并使下游的效應(yīng)細(xì)胞和分子發(fā)揮作用以清除外來抗原。佐劑通過T輔助細(xì)胞引起的B淋巴細(xì)胞的活性效應(yīng)可以通過評價總IgG抗體生成水平來實現(xiàn)。對IgG1和IgG2b抗體亞類的評價可以分別用于評價Th1和Th2免疫反應(yīng)的類型，為進(jìn)一步證實體外實驗中脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的特點是否能真實地反映小鼠體內(nèi)發(fā)生Th1/Th2免疫應(yīng)答的特點，筆者檢測了二免后14 d小鼠血清中總的IgG抗體，抗體亞型IgG2b（Th1型）和IgG1（Th2型）的水平。從各實驗組小鼠抗體效價水平分析，在疫苗中加入鋁膠佐劑對于提高小鼠血清中總IgG和IgG1效價能力上有顯著的效果，證實了鋁膠佐劑在機(jī)體可以激發(fā)Th2型免疫應(yīng)答的能力[10]。與鋁膠組相比較，ABPAW1免疫組相比有極顯著提高，兩抗體效價則低于鋁膠組。從抗體亞類IgG2b效價水平上分析，鋁膠結(jié)合OVA抗原免疫組小鼠對這種Thl型抗體亞類均無顯著作用，也再一次驗證了鋁膠佐劑在機(jī)體可以激發(fā)Th2型免疫應(yīng)答而無法有效激發(fā)Thl型免疫應(yīng)答。相反，ABP-AW1表現(xiàn)出較強(qiáng)的增強(qiáng)Thl型抗體亞類的特性，與鋁膠組相比，而ABP-AW1在較高劑量（100 μg）添加時卻能極顯著提高亞類的產(chǎn)生，表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)Th1型抗體亞類的能力。

在疫苗佐劑有效性被肯定的同時，安全性是佐劑本身也正面臨越來越嚴(yán)重的挑戰(zhàn)?；诓煌睦砟?，人們創(chuàng)造或發(fā)現(xiàn)了大量的新型佐劑。但是，由于佐劑本身容易引發(fā)局部或全身的副反應(yīng)，造成這些佐劑都或多或少在臨床的使用上存在局限性。減少或替代佐劑中的毒性成分；多種分子佐劑的聯(lián)合使用，能更好的控制機(jī)體體內(nèi)免疫系統(tǒng)的平衡，是最大程度地降低佐劑毒副作用的理想方案。比單一分子佐劑的使用更有優(yōu)勢。如就同一類分子佐劑受體而言（以TLRS為例），因其有多重形式，每種具體類型的受體引發(fā)的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)也存在很大差異[11-12]。

由特定的碳水化合物佐劑確定效能和/或毒性地位之差異，碳水化合物對抗炎信號起到一個雙向調(diào)節(jié)作用[13-15]。碳水化合物結(jié)構(gòu)很少只與一個受體結(jié)合，通常與四或更多個不同的免疫受體相結(jié)合，甚至這也可能低估了大多數(shù)多聚體的碳水化合物結(jié)構(gòu)可能結(jié)合的總的受體數(shù)量。碳水化合物佐劑觸動的免疫受體在決定最終免疫反應(yīng)結(jié)果是十分重要的。因此，筆者推測ABP-AW1佐劑可與多個不同的免疫受體相結(jié)合，通過結(jié)合與之相對應(yīng)的位于細(xì)胞表面的受體，向胞內(nèi)傳遞復(fù)雜的信號，信號經(jīng)級聯(lián)放大后，控制和調(diào)節(jié)各類細(xì)胞因子的表達(dá)、分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的水平。本實驗的安全性檢測也顯示，所有接種鼠均表現(xiàn)正常，生長發(fā)育良好，未發(fā)現(xiàn)主要臟器出現(xiàn)抗原所致的繼發(fā)性免疫病理損傷。

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