徐春華 劉越 肖利民 鄧圣澤 李東海

隨著分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，腫瘤的基因療法倍受關(guān)注，其中自殺基因療法顯示了較好的應(yīng)用前景，HSV-TK/GCV系統(tǒng)是目前研究較為廣泛的自殺基因治療系統(tǒng)，研究表明，單一基因治療效果不佳，而自殺基因與免疫治療相結(jié)合是研究發(fā)展的趨勢，可增強旁殺傷作用和激發(fā)腫瘤局部的免疫反應(yīng)[1-2]。所以為了研究腺病毒載體介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）與細胞因子白細胞介素-18（IL-18）基因聯(lián)合應(yīng)用對C6鼠腦膠質(zhì)瘤細胞的治療效果，本實驗擬通過構(gòu)建含TK及IL-18基因的重組腺病毒載體，為腫瘤的基因治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）細胞株與質(zhì)粒：PVA腺病毒載體 pAdtrackCMV、pAdEasy-1、大腸桿菌 E.coli，293細胞。（2）試劑：限制性內(nèi)切酶XbaI、Kpn、Pme I、EcoR I、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒、堿性磷酸酶CIAP、DNA提取試劑盒等均購自TaKaRa公司；胰蛋白酶，小牛血清，DMEM，Polybrene，DMSO為Sigma公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、DNA Ladder：Invitrogen公 司 膠回收小量試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；中量質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.2 方法 通過在NCBI上的檢索，在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中獲取基因IL-18、TK的全長序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v 2.0設(shè)計，由invitrogen公司合成。擴增IL-18及TK基因，IL-18引物序列：上游：5’-cacGGTACCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG T-3’下游：5’-gcTCTAGACTAGTCTTCGTTTTGAACAG TGAA-3’，預(yù)計長度：582 bp；TK 引物序列：上游：5’-cacGGTACCATGAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3’， 下游：5’-gcTCTAGATCAGTTGGCAGGGCTGCATTGCAG AATC-3’，預(yù)計長度：705 bp。經(jīng)各自反應(yīng)條件后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，鋪瓊脂板后，37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10~12 h。挑取含有目的基因的候選克隆，采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建AdCMV-TK及AdCMV-IL-18。

1.3 AdCMV-TK與AdCMV-IL-18的PCR鑒定 分別將AdCMV-TK及AdCMV-IL-18重組腺病毒液2 mL感染80%融合的293細胞，待單層細胞大部分變圓但尚未脫落時收集細胞，反復(fù)凍融3次，取少許提取腺病毒DNA，進行PCR鑒定，并以一個目的基因不同的重組病毒為陽性對照，采用純水作為陰性對照。鑒定引物：上游：5’-ACCAAGGAAATCGGCCTCTAT-3’，下游：5’-GCCATACCTCTAGGCTGGCTAT -3’，預(yù)計長度：115 bp；TK引物序列：上游：5’-TGCATTAACCTGCCCACTGT-3’，下游：5’-AAAACTGCCCCTCGTCGAT-3’，預(yù)計長度：298 bp。

1.4 制備并純化高滴定度腺病毒 回合1：從初級轉(zhuǎn)染溶胞產(chǎn)物放大：干冰/甲醇浴冷凍細胞，37 ℃水浴解凍循環(huán)4次以從細胞釋放病毒。用清潔的溶胞產(chǎn)物進行下一回合的放大或-80 ℃保存?；睾?和3：中等規(guī)模的放大后；原種儲存于-80 ℃。OD260檢測病毒滴度。測量OD260時，加15 μL病毒和15 μL空白溶液至100 μL TE/0.1%SDS，旋轉(zhuǎn)30 s，離心5 min，測量。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增TK及IL-18基因產(chǎn)物的電泳結(jié)果 從圖1中分析，擴增的條帶與預(yù)期的大小相符，說明得到的正是目的條帶（TK：705 bp；IL-18：582 bp）。

2.2 重組腺病毒TK及IL-18的PCR鑒定 PCR電泳顯示特異性預(yù)計大小的片段，證明重組腺病毒含有TK基因及 IL-18基因，見圖 2~3（TK：298 bp；IL-18：115 bp）。

圖1 PCR擴增目的基因的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 AdCMV-TK的PCR鑒定

圖3 AdCMV-IL-18的PCR鑒定

2.3 病毒滴度的測定 測得重組腺病度滴度為：AdCMV-TK=1.28×109PFU/mL， AdCMV-IL-18=1.28×109PFU/mL。

3 討論

在現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)飛速發(fā)展的推動下，腫瘤的生物學(xué)治療日益受到人們的重視，顯示出良好的應(yīng)用前景。基因治療是生物學(xué)治療的一個重要組成部分，有效的基因治療依賴于外源基因在受體中高效、穩(wěn)定的表達，而這在很大程度上取決于基因治療所采用的載體系統(tǒng)，基因治療多為病毒性載體，常見的病毒性載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒等，而以腺病毒為載體的治療在基因治療研究中應(yīng)用廣泛[3-4]。

腺病毒是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，在體內(nèi)療法的基因轉(zhuǎn)移中具有很大的優(yōu)勢[5-6]，由于其感染細胞時DNA不整合到宿主染色體上，不存在激活致癌基因或插入突變等危險，制備容易，操作簡單。腺病毒載體具有以下優(yōu)點：（1）人類是腺病毒的自然宿主，因此較為安全；（2）靶細胞范圍廣，它不但能感染復(fù)制分裂細胞，也能感染非分裂細胞，并且能介導(dǎo)體內(nèi)多種組織的基因轉(zhuǎn)移，如肺、腦、神經(jīng)系統(tǒng)等；（3）滴度高，可達1011~1012PFU/mL；（4）可在腸道內(nèi)及呼吸道內(nèi)繁殖，它的重組病毒可由靜脈注射、腸道吸收或氣管內(nèi)滴注等多類方式給予，以達到有效的基因轉(zhuǎn)移和治療；（5）該載體沒有包膜，不容易被其補體所滅活，可直接在體內(nèi)使用[7-8]。但載體也有不足之處：（1）基因轉(zhuǎn)移缺乏特異性；（2）載體是一種非整合載體，對于非分裂相細胞，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可持續(xù)表達幾個月，但對于增殖旺盛的細胞，要達到長期的基因表達，則需重復(fù)給予；（3）重復(fù)給予時機體可能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，影響基因表達和治療效果。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤，約占全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的45%~55%，傳統(tǒng)的手術(shù)、放療及化療等聯(lián)合治療效果不理想，低級別膠質(zhì)瘤患者平均生存3~5年，而高級別膠質(zhì)瘤則為1~2年[8-10]。自殺基因治療在膠質(zhì)瘤的基因治療中占有極為重要的地位，自殺基因療法是指將某些病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細胞，此基因編碼的特異性酶類能將細胞無毒或毒性極低的藥物前體在腫瘤細胞內(nèi)代謝成細胞毒性產(chǎn)物，以達到殺死腫瘤細胞為目的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，只要少量的自殺基因轉(zhuǎn)染的癌細胞與未轉(zhuǎn)染的癌細胞按一定比例混合后共同培養(yǎng)，不僅轉(zhuǎn)染的癌細胞被殺滅，二者相互接觸后相鄰的未轉(zhuǎn)染的癌細胞也大量死亡，即“旁觀者效應(yīng)”[12-14]。但是自殺基因治療不能有效地激發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，機體免疫反應(yīng)是自殺基因旁觀者效應(yīng)的主要因素，免疫基因治療雖可提高腫瘤細胞的免疫原性，誘導(dǎo)機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，但直接殺傷腫瘤作用不強，因此可將自殺基因及免疫基因治療聯(lián)合應(yīng)用以增強療效[15]。

本實驗為研究HSV-TK與IL-18基因聯(lián)合應(yīng)用對C6鼠腦膠質(zhì)瘤細胞的抑瘤效果，進行了前期重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定工作，結(jié)果顯示：通過采用腺病毒作為載體，經(jīng)DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建了重組腺病毒AdCMV-TK及AdCMV-IL-18，病毒滴度高，均為1.28×109PFU/mL，為今后腫瘤基因治療的體內(nèi)外進一步研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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