高亞維，哈敏文

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 錦州 121000；2.遼寧撫順市傳染病醫(yī)院 三療區(qū)，遼寧 撫順 113015）

CIP2A在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及患者預(yù)后分析

高亞維1，哈敏文2Δ

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 錦州 121000；2.遼寧撫順市傳染病醫(yī)院 三療區(qū)，遼寧 撫順 113015）

目的研究蛋白磷酸酶2A的抑癌因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的差異表達(dá)情況及探討其臨床意義及潛在的預(yù)后價(jià)值。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測(cè)60例NSCLC癌組織及其癌旁正常組織2組中CIP2A表達(dá)情況，通過檢測(cè)CIP2AmRNA及蛋白的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理資料和預(yù)后因素的關(guān)系。結(jié)果CIP2A mRNA肺癌組織比癌旁組織高表達(dá)（P＜0.01）；CIP2A的蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P＜0.01）。CIP2A的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌組織的分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、TNM（tumor nodemetastasis）分期無關(guān)。結(jié)論CIP2A在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且隨著非小細(xì)胞肺癌組織分化程度的增高及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高。CIP2A及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

非小細(xì)胞肺癌；蛋白磷酸酶2A的抑癌因子；實(shí)時(shí)定量；免疫組織化學(xué)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：60例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織收集于2008年～2014年在遼寧醫(yī)學(xué)院進(jìn)行治療的NSCLC患者。所有患者術(shù)前均未行放療和化療，并經(jīng)過病理確診。其中男性51例，女性9例，年齡27～83歲。TNM（topography lymph nodemetastasis，TNM）分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2002年美國聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)（American joint committee on cancer classification，AJCC）和國際抗癌聯(lián)盟制定標(biāo)準(zhǔn)。本組病例9例失訪，隨訪率為85%，隨訪開始時(shí)間為2008年6月，生存時(shí)間計(jì)算以月為單位，隨訪時(shí)間：手術(shù)日期到隨訪截止日期（2014年1月為止）或肺癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡的日期，最短隨訪時(shí)間為0.5個(gè)月，最長隨訪日期為66個(gè)月。完全失訪病例和非腫瘤原因死亡病例按統(tǒng)計(jì)學(xué)要求以截尾數(shù)據(jù)處理。

1.1.2 材料：提取 RNA Trizol、氯仿、異丙醇及無水酒精，Tip-5和β-actin基因的引物等購于中國沈陽立信生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA的試劑盒由大連TAKARA生物公司生產(chǎn)，2步法real-time PCR試劑盒及提取RNA試劑盒均購自大連TAKARA生物公司，兔抗人CIP2A多克隆抗體（英國Abcam，稀釋濃度1∶200）及S-P免疫組化試劑盒（2步法抗兔／鼠通用型免疫組化試劑盒，福州邁新）購于北京中杉生物技術(shù)有限公司，DAB溶液PBS（PH＝7.4）購于福州邁新生物科技有限公司；RM2135切片機(jī)產(chǎn)自Leica公司，BX51顯微鏡照相機(jī)及產(chǎn)自O(shè)lympus公司，電熱恒溫水浴箱CS501產(chǎn)自重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，醫(yī)用微波爐干燥箱產(chǎn)自上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.2 方法

1.2.1 real-time PCR檢測(cè)CIP2A mRNA表達(dá)：提取癌和癌旁組織總RNA均參照試劑盒說明，在Real Time-System TP800系統(tǒng)上行純度檢測(cè)，然后通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反應(yīng)體系25μL）。將剩余的總 RNA存于-70℃冰箱待用。按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000 4個(gè)濃度梯度對(duì)cDNA進(jìn)行稀釋，以β-Actin在4個(gè)濃度梯度下進(jìn)行對(duì)照，分別測(cè)得4個(gè)不同的Ct值，觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系是否可行。CIP2A cDNA的表達(dá)高低的判斷標(biāo)準(zhǔn)：通過2（-ΔΔCT）方法，界定值：2（-ΔΔCT）值 ＞1.0視為高表達(dá)，＜1.0視為低表達(dá)。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)CIP2A表達(dá)：48例NSCLC及癌旁正常組織先經(jīng)甲醛溶液固定，然后使用石蠟包埋，采用連續(xù)切片的方法，確保每片厚為4μm。再進(jìn)過高溫抗原修復(fù)程序，并使用PBS反復(fù)沖洗3次（5min），使用50μL的一抗滴加在每張切片上，在40℃的冰箱孵育過夜，取出后再使用PBS沖洗3次，每次時(shí)長5min，在使用50μL的二抗滴加，再次放到室溫孵育30min，取出后使用PBS沖洗3次，每次時(shí)長5min，DAB顯色后使用中性樹膠進(jìn)行封片，陰性對(duì)照為PBS代替一抗。結(jié)果確定標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下每張切片選取癌細(xì)胞較多的10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，無陽性細(xì)胞為“-”，陽性細(xì)胞數(shù)小于等于5%為“＋”，陽性細(xì)胞數(shù)在6%至20%區(qū)間的為“＋＋”，陽性細(xì)胞數(shù)大于20%為“＋＋＋”，其中“＋”和“－”視為低表達(dá)，“＋＋”視為中表達(dá)，“＋＋＋”視為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，配對(duì)樣本采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；Log-rank檢驗(yàn)判斷差異性，生存分析采用K-M法。COX回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 目的基因CIP2A標(biāo)準(zhǔn)曲線其相關(guān)系數(shù)為0.999 84、管家基因β-Actin標(biāo)準(zhǔn)曲線其相關(guān)系數(shù)為0.999 67（如圖1、圖2）。CIP2A與 β-Actin M值分別為-3.254、-3.347，2組間M值之差的絕對(duì)值小于0.1。溶解曲線：其峰值單一，說明cDNA純度高（如圖3），擴(kuò)增曲線起峰說明基因具有擴(kuò)增（如圖4）。

圖1 癌組織目的基因CIP2A Fig.1 Carcinoma target gene CIP2A

圖2 癌組織中的內(nèi)參基因β-actin Fig.2 Carcinoma reference geneβ-actin

圖3 溶解曲線Fig.3 Melting curve

圖4 擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curve

2.2 不同組織中CIP2A的mRNA表達(dá)水平 CIP2A的mRNA在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（P＜0.01，見圖5）；癌組織中高表達(dá)CIP2A例數(shù)為48例，占80.00%。

圖5 CIP2A在NSCLC組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of CIP2A in NSCLC tissues

2.3 不同組織中CIP2A蛋白表達(dá) 48例非小細(xì)胞肺癌癌組織中高表達(dá)12例，中表達(dá)12例，低表達(dá)12例，癌旁正常組織12例無表達(dá)。CIP2A蛋白定位在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，CIP2A的蛋白在癌組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P＜0.01，見圖6）。

圖6 CIP2A在癌及其癌旁正常組織中的表達(dá)（×400）Fig.6 Expression of CIP2A in NSCLC and paraneoplastic normal（×400）

2.4 CIP2A mRNA在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系 CIP2A mRNA在NSCLC中的表達(dá)水平在腫瘤大小、年齡、組織學(xué)分級(jí)、性別、TNM分期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤細(xì)胞的分化程度間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 CIP2A mRNA表達(dá)水平在NSCLC患者臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expression of CIP2A and clinicopathological characteristics of NSCLC patients

2.5 CIP2A mRNA的表達(dá)水平與NSCLC預(yù)后 通過K-M生存分析及Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIP2A mRNA高表達(dá)組的5年生存率顯著低于CIP2A mRNA低表達(dá)組（P＜0.05，見圖7）。

臨床病理指標(biāo)包括：性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化。單因素分析顯示：CIP2A、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均影響預(yù)后（P＜0.05）。

圖7 CIP2A mRNA的表達(dá)水平與NSCLC患者K-M生存曲線Fig.7 Kaplan-Meier survival curve of the expression of CIP2A in 60 patientswith NSCLC

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CIP2AmRNA在NSCLC中的表達(dá)水平與腫瘤大小、年齡、組織學(xué)分級(jí)、性別、TNM分期等因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞的分化程度等因素差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。60例NSCLC患者中CIP2A mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)水平其患者的預(yù)后較差，多因素分析顯示CIP2A表達(dá)水平和是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響生存率的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05）。Ckelman等［12-13］對(duì)29例 NSCLC癌組織中 CIP2AmRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中24例當(dāng)中CIP2A的表達(dá)顯著增高，而在正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)。進(jìn)一步從基因水平上研究發(fā)現(xiàn)，CIP2A基因表達(dá)與CMYC基因表達(dá)有關(guān)，這與本研究結(jié)果相似。另外，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)90例NSCL患者癌組織中CIP2A蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽性表達(dá)65例，陽性表達(dá)率72.2%，通過追蹤隨訪發(fā)現(xiàn)CIP2A高表達(dá)者預(yù)后差。檢測(cè)CIP2A在肺癌患者組織中的表達(dá)水平可作為判斷預(yù)后的一個(gè)重要項(xiàng)目。Janssens等［14-15］采用相同的方法對(duì)60例肺癌術(shù)后患者的癌組織以及對(duì)應(yīng)正常癌旁組織進(jìn)行了CIP2A表達(dá)情況的檢測(cè)，結(jié)果顯示在癌組織中CIP2A高表達(dá)有38例，高表達(dá)率為63.3%，而CIP2A在正常癌旁組織中低表達(dá)或陰性表達(dá)。大量的研究證明顯示CIP2A在肺癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與肺癌患者病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后有很大關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。目前，腫瘤治療仍是臨床治療中所面臨的重大挑戰(zhàn)，隨著分子靶向治療的應(yīng)用，如何進(jìn)一步提高患者的生存率，找到針對(duì)CIP2A進(jìn)行抗腫瘤治療的有效藥物，更為有效的聯(lián)合用藥和治療方案仍需繼續(xù)探索。

［1］ Soo Hoo L，Zhang JY，Chan EK.Cloning and characterization ofa novel 90 kDa‘companion’autoantigen of p62 overexpressed in cancer［J］.Oncogene，2002，21（32）：5006-5015.

［2］ Ruvolo PP，Deng X，Carr BK，et al.A functional role formitochondrial protein kinas e Calpha in Bcl2 phosphorylat i on and suppressi on of apoptosis［J］.JBiol Chem，1998，273（39）：25436-25442.

［3］ Sch?nthal AH.Role of serine／threonine protein phosphatase 2A in cancer［J］.Cancer Lett，2001，170：1-13.

［4］ Veerle J，Jozef G，Christine VH.PP2A：The expected tumor suppressor［J］.Current Opinion in Gene t ics＆Dev elopment，2005，15（1）：34-41.

［5］ Wang H，Hammoudeh DI，F(xiàn)ollis AV，et al.Improved low molecular weight Myc-Max inhibitors［J］.Mol Cancer Ther，2007，6：2399-2408.

［6］ Sontag E.Protein phosphatase 2A： the trojan horse of cellular signaling［J］.Celluar Signalling，2001，13（1）：7-16.

［7］ Hahn WC，Dessain SK，Brooks MW，et al.Enumeration of the simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation［J］.Mol cell Biol，2002，22（7）：2111-2123.

［8］ Arroyo JD，Hahn WC.Involvement of PP2A in viral and cellular transformation［J］.Oncogene，2005，24（52）：7746-7755.

［9］ Huang LP，Adelson ME，Mordechai E，et al.CIP2A expression is elevated in cervical cancer［J］.Cancer Biomark，2011，8（6）：309-317.

［10］ Junttila MR，Puustinen P，Niemela M，et al.CIP2A inhibits PP2A in human malignancies［J］.Cell，2007，130（1）：51-62.

［11］ Zolnierowicz S.Type2Aprotein phosphatase，the complex regulator of numerous signaling pathways［J］.Biochemistry and Pharmacology，2000，12（5）：99-101.

［12］ B?ckelman C，Koskensalo S，Hagstr?m J，et al.CIP2A overex-pression is associated with c-Myc expression in colorectal canc-er.Cancer Biology and Therapy，2012，12（2）：222-224.

［13］ Ieta K，Ojima E，Tanaka F，et al.Identification of overexpressed genes in hepatocellular carcinoma，with special reference to ubiquitinconjugating enzyme E2C gene expression［J］.International Journal of Cancer，2007，33（1）：99-101.

［14］ Janssens V，Goris J.Protein phosphatase 2A：a highly regulated family of serine／threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling［J］.Biochemical Journal，2011，6（2）：11-19.

［15］ Bockelman C， Hagstr?m J， M?kinen LK， et al.High CIP2 Aimmunoreactivity is an independent prognostic indicator in ear-lystage tongue cancer［J］.British Journal of Cancer，2011，3（4）：134-135.

（編校：李璐璐）

Analysis of CIP2A expression and prognosis in non-small cell lung cancer patients

GAO Ya-wei1，HA Min-wen2Δ

（1.Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.The Third Ward，The Municipal Infectious Hospital of Fushun，F(xiàn)ushun 113015，China）

ObjectiveTo study the different expressions of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A（CIP2A）in non-small cell lung cancer（NSCLC），investigate its clinical significance and potential prognostic value.MethodsImmunohistochemical and real-time polymerase chain reaction（PCR）were used to detect the expressions of CIP2A mRNA and protein in two groups of sixty paired NSCLC specimens and adjacent non-cancer tissues.The relationship between its expression and clinical pathological data and prognostic factors were analysed.ResultsThe expression of CIP2A mRNA in NSCLC specimenswas higher than those in adjacent non-cancer tissues（P＜0.01）；The expression of CIP2A protein in NSCLC tissueswas significantly higher than that in the corresponding adjacent non-cancer tissues（P＜0.01）.The expression of CIP2A was closely correlated with the differentiation and lymph nodemetastasis of NSCLC tissues（P＜0.05），while incorrelated with sex，age，pathematology type，tumor size and tumor nodemetastasis（TNM）stage.ConclusionCIP2A highly expresses in NSCLC，and the expression of CIP2A will increase with the differentiation and lymph nodemetastasis of NSCLC tissues.The expression of CIP2A and lymph nodemetastasis can be used as an independent risk factor for the prognosis of patients with NSCLC.

non-small cell lung cancer；cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A；real-time；immunohistochemistry

R734.2

A

1005－1678（2014）04－0081－04

肺癌是目前全球癌癥死亡的首要原因，非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的80%。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）惡性程度高，預(yù)后差，故研究其預(yù)后因素，對(duì)于判斷預(yù)后、指導(dǎo)合理的臨床治療、提高生存率非常重要。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是能夠抑制腫瘤的蛋白磷酸酶，2002年Hoo等［1］發(fā)現(xiàn)PP2A在胃癌組織和肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，隨后命名蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A），它能夠抑制PP2A的生物活性。全酶在細(xì)胞中的定位由結(jié)構(gòu)亞基、調(diào)節(jié)亞基B和催化亞基C組成［2］，A亞基為支架作用；B亞基決定其底物專一性，C亞基具有催化活性。這決定了PP2A在多種生理活動(dòng)中起到很大作用［3］。PP2A是一種腫瘤抑制因子［4-6］，其活性的抑制被認(rèn)為是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的前提條件［7］，但是相關(guān)機(jī)制尚不清楚。CIP2A是與PP2A具有相互作用的內(nèi)源性蛋白，它能夠識(shí)別癌細(xì)胞中與PP2A相互作用的蛋白，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提示CIP2A在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用［8-11］。本研究通過real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)60例NSCLC及癌旁正常組織中CIP2A mRNA及蛋白的表達(dá)水平，并分析CIP2A的表達(dá)水平和臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，從而得出CIP2A的表達(dá)水平與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012225019）

高亞維，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：非小細(xì)胞肺癌的診治，E-mail：gaoyawei_gyw＠163.com；哈敏文，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：肺癌的診斷化療及靶向治療，E-mail：haminwen＠163.com。