袁敏，羅建成，侯俊然，李晶，陳志國(guó)

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 南陽(yáng) 473004；2.南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004）

紫外分光光度法測(cè)定鏈霉菌NG-715抗真菌組分的含量

袁敏1，羅建成2，侯俊然1，李晶1，陳志國(guó)1

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 南陽(yáng) 473004；2.南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004）

目的運(yùn)用紫外分光光度法測(cè)定鏈霉菌NG-715抗真菌組分的含量。方法以鏈霉菌NG-715抗真菌組分為指標(biāo)性成分，在339 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果紫外分光光度法測(cè)定鏈霉菌NG-715抗真菌組分濃度在8μg／mL～20μg／mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.98%（n＝6），RSD＝0.11%。結(jié)論本法快速準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)便易行，可用于鏈霉菌NG-715抗真菌組分含量的測(cè)定。

鏈霉菌NG-715；抗真菌組分；紫外分光光度法

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：經(jīng)AKTA Explorer 100高效液相色譜儀制備后，以無(wú)水甲醇作為對(duì)照，以無(wú)水甲醇溶解并進(jìn)行分析后純度達(dá)到90%的抗真菌組分。

1.1.2 抑菌測(cè)定指示菌：黑曲霉（Aspergillus niger）由本校生物與化學(xué)工程學(xué)院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基：指示菌斜面、平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基［7］。

1.1.4 主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋（寧波開普YXQ-50LS）；無(wú)菌操作工作臺(tái)（蘇州華宏BCM-1000）；生化恒溫培養(yǎng)箱（蘇州華宏SPX-250F）；電子天平（北京賽多利斯ALC-2100.2）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津UV-VIS3150）；AKTA Explorer 100高效液相色譜儀（制備型），制備柱MuMing Packing Material（25mm×30 cm）；Beckman System Gold高效液相色譜儀（分析型），分析柱Beckman Coulter UL Transphere ODS（4.6mm×25 cm）等。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定［8］：取經(jīng)高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）制備分析后純度為90%的抗真菌組分樣品的乙醇溶液用UV-VIS3150紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，以無(wú)水乙醇溶液作為空白對(duì)照，選擇吸收度最大的波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［9］：取用無(wú)水乙醇配制成的8、10、12、14、16、18、20μg／mL的抗真菌組分樣品溶液，以無(wú)水乙醇作空白對(duì)照，測(cè)吸收度A，得出吸收度A與濃度C之間的線性回歸方程。

1.2.3 精密度試驗(yàn)［10］：取用無(wú)水乙醇配制成的15μg／mL的抗真菌組分樣品溶液5份，以無(wú)水乙醇作空白對(duì)照，在最大波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸收值，以觀察儀器的精密度。

1.2.4 穩(wěn)定性測(cè)定［11］：將1.2.2中配制成的不同濃度的抗真菌組分樣品溶液在室溫條件下放置0 h、1 h、5 h、15 h、20 h后，測(cè)吸收度，以觀察該法的穩(wěn)定性。

1.2.5 回收率測(cè)定［12］：取1mL已知含量的樣品溶液6份，分別加入20μg／mL抗真菌組分標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，蒸餾水定容，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，用回歸方程計(jì)算平均回收率。

1.2.6 2種方法樣品測(cè)定：取發(fā)酵液樣品溶液，分別用微生物檢測(cè)法、紫外吸收法進(jìn)行含量測(cè)定，采用SAS Version 6.12軟件進(jìn)行分析，用配對(duì)t檢驗(yàn)來檢測(cè)2種方法是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 鏈霉菌NG-715抗真菌組分在323 nm、339 nm、358 nm有3個(gè)較大的吸收峰，其中339 nm吸收度最大，選擇339 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表1 抗真菌組分的紫外-可見光檢測(cè)表Tab.1 Results for UV-vis spectra of the antifungal component

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 測(cè)定結(jié)果表明該物質(zhì)濃度與吸收度之間的線性回歸方程 y＝0.0366x＋0.001 7，R2＝0.999 9，在 8～20μg／mL范圍內(nèi)吸光度與濃度成正比（見圖1）。

圖1 抗真菌組分紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the antifungal component by UV-spectrophotometry

2.3 精密度試驗(yàn) RSD為0.06，本方法精密度良好（見表2）。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of precision

2.4 穩(wěn)定性測(cè)定 不同濃度樣品在不同時(shí)間吸收度基本無(wú)變化，穩(wěn)定性良好（見表3）。

表3 抗真菌組分放置不同時(shí)間的吸光值Tab.3 The absorbency values of the antifungal component by spectrophotometry at different times

2.5 回收率測(cè)定 平均回收率為99.98%，RSD為0.11%，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求（見表4）。

表4 分光光度法的回收率Tab.4 Recovery of the antifungal component by spectrophotometry

2.6 樣品測(cè)定 取發(fā)酵液樣品溶液，分別用生物檢測(cè)法、紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定。由測(cè)定結(jié)果可知：2種方法測(cè)定同一樣品，所獲得的結(jié)果非常接近，分別為 734.79μg／mL和741.6μg／mL，用配對(duì)t檢驗(yàn)來檢驗(yàn)2種方法是否存在差別，采用SASVersion 6.12軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，2者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異（見表5）。

表5 發(fā)酵液中抗真菌成分含量的測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of the antifungal component determination

3 討論

分光光度法被廣泛地應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域［13-15］。本實(shí)驗(yàn)用紫外分光光度法建立了鏈霉菌NG-715抗真菌組分的分析方法，以無(wú)水乙醇為溶劑，選取最大吸收波長(zhǎng)339 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，獲得鏈霉菌NG-715抗真菌組分的濃度在8μg／mL～20μg／m L范圍內(nèi)吸光度與濃度成正比。其回歸方程為 y＝0.0366x＋0.0017，R2＝0.9999，可用來測(cè)定鏈霉菌 NG-715抗真菌組分的含量，為該殺菌劑的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

利用此法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，回收率良好，平均回收率為99.98%，RSD為0.11%（n＝6）；精密度試驗(yàn)RSD為0.06%；經(jīng)t檢驗(yàn)，與抗生素微生物檢定法測(cè)定結(jié)果比較無(wú)顯著差異。與藥典中抗生素微生物檢定法［16］操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境條件及操作者技術(shù)要求高，偶然誤差大，精確度不太高等弊端比較，該法具有操作簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、檢驗(yàn)周期短、重現(xiàn)率高等優(yōu)點(diǎn)，適于對(duì)鏈霉菌NG-715抗真菌組分的快速測(cè)定。

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（編校：李璐璐）

UV spectrophotometric determ ination of the antifungal com ponent produced by Streptom yces NG-715

YUAN Min1，LUO Jian-cheng2，HOU Jun-ran1，LIJing1，CHEN Zhi-guo1

（1.Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China；2.College of Biology and Chemistry Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

ObjectiveTo establish amethod for the determination of the antifungal component produced by Streptomyces NG-715.MethodsThe antifungal component was used as the reference component for UV spectrophotometry detemined at 339 nm.ResultsBy spectrophotometry，a good linearity was established within 8μg／mL～20μg／mL，and the average recovery rate was 99.98%（n＝6）with RSD being 0.11%.ConclusionThe method is simple，rapid，accurate with good reproducibility for determining the antifungal component produced by Streptomyces NG-715.

Streptomyces NG-715；antifungal component；UV spectrophotometry

Q936

A

1005－1678（2014）04－0169－03

分光光度法是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法［1］。該方法操作簡(jiǎn)便，廣泛應(yīng)用于抗菌物質(zhì)的測(cè)定［2-4］。鏈霉菌NG-715菌株是2008年7月15日從南陽(yáng)理工學(xué)院東南校區(qū)張仲景國(guó)醫(yī)學(xué)院藥用植物園所采集的120份土樣中篩選得到的，前期研究顯示其抗真菌組分對(duì)啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉、黑根霉均有抑制和殺滅作用；且在對(duì)啤酒酵母和桔青霉的抑制效果上，NG-715優(yōu)于那他霉素，有望開發(fā)成新型高效殺菌劑［5-6］。前期的微生物檢測(cè)法測(cè)得在抗真菌組分的質(zhì)量濃度為40μg／mL～80μg／mL范圍具有良好的線性，其抑菌圈直徑（y）與濃度的對(duì)數(shù)值（x）之間的線性回歸方程為 y＝26.963x－27.6，R2＝0.9991，可以用來計(jì)算鏈霉菌 NG-715抗真菌組分的含量［6］。但該法費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，操作繁瑣，不適合快速檢測(cè)。本文采用紫外分光光度法測(cè)定鏈霉菌NG-715抗真菌組分的含量，并與前期的微生物檢測(cè)法進(jìn)行比較。

南陽(yáng)理工學(xué)院青年基金項(xiàng)目（NG2009QNJJ10）；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（142102310508）

袁敏，女，碩士，講師，研究方向：微生物代謝產(chǎn)物的分離提取，E-mail：ymin37＠163.com。