郝春艷

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 護(hù)理部，遼寧 錦州 121001）

蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液對(duì)過氧化氫致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

郝春艷

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 護(hù)理部，遼寧 錦州 121001）

目的研究蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液對(duì)過氧化氫損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。方法P12細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、造模組、低濃度組（1%蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液）、中濃度組（3%蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液）和高濃度組（5%蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液），培養(yǎng)24h后除陰性對(duì)照組外，其他各組加入H2O2繼續(xù)培養(yǎng)24h，比較各組細(xì)胞存活率、LDH活性以及NO含量。結(jié)果造模組存活率為（62.8±4.2）%，陰性對(duì)照組存活率為（100.0±1.7）%，造模組顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），加入復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液組細(xì)胞存活率較造模組顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞LDH水平以及NO含量，造模組與陰性對(duì)照組比較，均顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01），加入復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液后，LDH水平以及NO含量較造模組顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液對(duì)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。

蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液；過氧化氫；P12細(xì)胞

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株，由上海艾研生物科技有限公司提供，蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液由本實(shí)驗(yàn)室配制，主要成分為蟲草、猴頭、靈芝。配制方法：3種食用菌發(fā)酵后提取發(fā)酵液及菌絲體，混合，粉碎，膠體磨破碎，離心，超聲波處理，獲得發(fā)酵液及菌絲體混合物。NO試劑盒（拜力生物），LDH試劑盒（上海谷研試劑有限公司）。PT-3502型酶標(biāo)儀（北京普天），TGL-16M低溫離心機(jī)（馳騁華星科技有限公司），BSC-1300IIA2生物安全柜（百典），Touch190 CO2培養(yǎng)箱（瑞士康科技），S-2低壓吸引器（寧波戴維醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試劑及培養(yǎng)基配制：配制濃度10mM的過氧化氫溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基，10%高滲鹽水，5%FBSDMEM培養(yǎng)基，4℃保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：將PC12細(xì)胞置于10%HS，5%FBSDMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞從液氮罐中取出，解凍，吸出細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)基，吹打混勻，離心后，棄去上清，再次加入培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 分組：低劑量組加入1%的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，中劑量組加入3%的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，高劑量組加入5%的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，另設(shè)H2O2造模組和陰性對(duì)照組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，配制成1×105個(gè)／mL，接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液，造模組和陰性對(duì)照組加入PBS液。培養(yǎng)24 h。取10 mM過氧化氫溶液16mL，加PBS液24mL，配制10mM濃度，除陰性對(duì)照組外，將配制好的H2O2加入各組，使終濃度為400 nM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率，酶標(biāo)儀550 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算存活率。檢測(cè)細(xì)胞LDH活性，用以反映細(xì)胞的受損情況，440 nm，測(cè)定吸光度，計(jì)算LDH活力。測(cè)定細(xì)胞NO含量，洗取細(xì)胞上清液，通過OD值計(jì)算上清液中NO的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)以及t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 造模組細(xì)胞存活率顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），加入復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液后，細(xì)胞存活率較造模組顯著升高（P＜0.01），并且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的存活率也逐漸升高（P＜0.01，見表1）。

表1 各組細(xì)胞存活率比較Tab.1 Comparison of cell viability in each group

2.2 各組細(xì)胞LDH活性比較 造模組LDH水平較陰性對(duì)照組顯著升高，而加入復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液組LDH水平較造模組顯著下降（P＜0.01）。但是隨著復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液濃度的增加，LDH水平有所升高，這可能與復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液濃度升高后對(duì)細(xì)胞有一定的損害，而導(dǎo)致部分細(xì)胞LDH滲漏有關(guān)（見表2）。

表2 各組細(xì)胞LDH活性比較Tab.2 Comparison of LDH activity in each group

2.3 各組細(xì)胞上清液NO含量比較 造模組上清液NO含量較陰性對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），加入復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液組NO含量較造模組顯著下降（P＜0.01），并且隨著濃度的增加，下降幅度越大（見表3）。

表3 各組上清液NO含量比較Tab.3 Comparison of NO in each group

3 討論

蟲草屬于寄生真菌的一種，隸屬于子囊菌亞門、核菌綱、肉座菌目，目前發(fā)現(xiàn)的已經(jīng)有400多種，其中許多種類都包含有重要的要用價(jià)值。其在中醫(yī)中的應(yīng)用歷史悠久，具有低脂、高蛋白、低熱等優(yōu)點(diǎn)［4］。大量研究顯示蟲草具有抗腫瘤、提高免疫力、降低血脂、調(diào)節(jié)代謝等作用［5］。其通過提高單核-巨噬細(xì)胞的吞噬作用、促進(jìn)器官的蛋白更新等作用調(diào)節(jié)免疫功能。蟲草還能夠提高血清IgM的水平、IgG的水平，從而調(diào)節(jié)體液免疫［6］。

本研究中所采用的蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液主要成分為蟲草、靈芝以及猴頭菌。猴頭菌和靈芝也是屬于我國(guó)傳統(tǒng)上名貴的食用菌種。猴頭菌具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤等作用。蟲草富含蟲草素、多糖、蟲草酸等，對(duì)抗腫瘤、提高免疫力、促進(jìn)內(nèi)循環(huán)等具有重要的作用。靈芝富含靈芝多肽和靈芝多糖，具有延緩衰老、抗腫瘤的作用。

腦組織中腦神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)由大量的不飽和脂肪酸，腦組織中鐵離子的濃度高，并且抗氧化酶水平較低，因此腦組織更容易遭受反應(yīng)性氧化的損傷。研究顯示多種神經(jīng)退行性疾病與氧化應(yīng)激相關(guān)，包括帕金森病和阿爾茲海默病［7-8］。PC12細(xì)胞源于神經(jīng)系統(tǒng)外胚層，其特征與多巴胺能神經(jīng)元相似，因具有可傳代的優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛被用于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)領(lǐng)域的研究。本研究目前使用的PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株。

神經(jīng)退行性病變是困擾老年患者的主要疾病，包括帕金森病以及阿爾茲海默病，目前尚無有效的治療方法。研究顯示當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到反應(yīng)性氧化攻擊時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)發(fā)生功能紊亂，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾?。?］。阿爾茲海默病與腦神經(jīng)細(xì)胞突觸退變以及神經(jīng)元的死亡具有密切的關(guān)系，膜脂質(zhì)大量不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜運(yùn)輸ATP酶、葡萄糖以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的功能損傷，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，ATP耗竭，鈣離子大量?jī)?nèi)流，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白的堆積［10-11］。帕金森病的發(fā)病機(jī)制是多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激，線粒體功能障礙，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致帕金森病患者黑質(zhì)神經(jīng)元死亡的主要原因［12］。

H202廣泛用于抗氧化的研究中。多巴胺氧化、淀粉蛋白聚集、腦缺血再灌注等均可產(chǎn)生大量的H202，而H202還可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為OH-，其毒性更大，可通過氧化神經(jīng)細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸脂質(zhì)而使細(xì)胞膜遭到破壞，還通過損傷DNA、蛋白質(zhì)等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。因復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液中既含有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，也含有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，因此本研究中，參考既往文獻(xiàn)的研究結(jié)果，當(dāng)復(fù)合菌液濃度超過5%時(shí)，其抑制作用比較明顯，選擇＜5%的濃度來研究復(fù)合菌液對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。

在本研究中，造模組細(xì)胞存活率顯著低于陰性對(duì)照組，細(xì)胞LDH水平、NO含量顯著高于陰性對(duì)照組。說明H2O2對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，能夠降低細(xì)胞的存活率。LDH和NO能夠反映細(xì)胞受損的情況。加入不同濃度的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液組其細(xì)胞存活率顯著升高，而LDH水平以及NO含量也顯著下降，說明復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，伴隨著復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液濃度的不斷增加，相應(yīng)的細(xì)胞的存活率也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，而NO含量逐漸下降，說明其對(duì)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用具有一定的濃度依賴性。但是濃度為1%的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液組LDH水平最低，而隨著濃度增加，LDH水平也逐漸增加，這可能是因?yàn)殡S著復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液濃度的增加，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的損害作用，從而導(dǎo)致部分細(xì)胞發(fā)生LDH滲漏。蟲草具有抗氧化應(yīng)激的作用，冬蟲夏草對(duì)超氧陰離子自由基和羥自由基具有清除作用。具有抗脂質(zhì)過氧化的作用，對(duì)體外細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。付健陽等［14］研究發(fā)現(xiàn)，蟲草通過改善機(jī)體微循環(huán)及氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)血脂水平等對(duì)1型糖尿病大鼠腎臟發(fā)揮保護(hù)作用。李風(fēng)華等［15］研究發(fā)現(xiàn)，蟲草菌絲能夠顯著大鼠肝纖維化模型大鼠超氧化物歧化酶（SOD）的活性，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液對(duì)體外PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用，抑制LDH的滲漏，并降低上清中的NO水平，但是蟲草復(fù)合液中既含有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)成分，也含有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，因此要根據(jù)不同的目的，選擇適合的濃度。

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（編校：吳茜）

Study on the protective effect of Cordyceps composite nutrient solution in hydrogen peroxide-induced PC12 cell injury

HAO Chun-yan

（Department of Nursing，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China）

ObjectiveTo study the protective effect of Cordyceps composite nutrient solution on hydrogen peroxide-induced PC12 cell injury.MethodsP12 cellswere divided into negative control group，model group，low-dose group（1%Cordyceps complex nutrient solution），middle dose group（3%Cordyceps complex nutrient solution）and high-dose group（5%Cordyceps complex nutrient solution）.After 24 h cultured，except the negative control group，other groups were added H2O2and cultured for another 24h.Cell viability，LDH activity and NO were compared in each group.ResultsSurvival rate inmodel group was（62.8±4.2）%，the survival rate of the negative control group was（100.0±1.7）%，the survival rate in themodel group was significantly lower than that in negative control group（P＜0.01），and cell viability increased significantly in composite nutrient solution group compared withmodel group（P＜0.01）.Cellular LDH levels and NO content in themodel group and negative control group were significantly higher than that in negative control group（P＜0.01），which decreased significantly when added cordyclps composite nutrient solution（P＜0.01）.ConclusionCordyceps composite nutrient solution shows protective effect on hydrogen peroxide in PC12 cells.

Cordyceps；nutrient solution；H2O2；PC12 cells

R282.71

A

1005－1678（2014）04－0050－03

當(dāng)氧化物的水平超過機(jī)體內(nèi)源性抗氧化作用的時(shí)候，會(huì)導(dǎo)致分子氧化，組織損傷，此為氧化應(yīng)激。腦組織中，腦神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)由高濃度的不飽和脂肪酸組成，并且腦組織中的抗氧化酶水平較低，因此腦組織容易受到過氧化物的損傷。研究顯示，氧化應(yīng)激與帕金森病、老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病相關(guān)［1-2］。蟲草具有抗氧化的作用，能改善體外細(xì)胞過氧化氫含量、過氧化氫酶活力等，蟲草素還具有清除自由基的作用［3］。P12細(xì)胞和多巴胺神經(jīng)元相似，來源于神經(jīng)系統(tǒng)外胚層。本文對(duì)蟲草復(fù)合營(yíng)養(yǎng)液損傷在過氧化氫致P12細(xì)胞中的作用進(jìn)行了探討。

遼寧省科技廳課題（201101575）

郝春艷，女，碩士，教授、主任護(hù)師、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：臨床護(hù)理、護(hù)理管理，E-mail：21127026＠qq.com。