劉彤崴，周盾，郝春艷

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 腎病內(nèi)科，遼寧 錦州 121001）

蟲草菌液對糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響

劉彤崴，周盾，郝春艷

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 腎病內(nèi)科，遼寧 錦州 121001）

目的探討蟲草菌液對糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。方法將不同濃度的蟲草菌液和高糖作用于人近端腎小管上皮細胞，根據(jù)加入劑量和組份不同分成以下5組：對照組給予5.5mmol／L D-葡萄糖；高糖組給予30mmol／L D-葡萄糖；實驗組1給予30mmol／L D-葡萄糖 ＋5μg／mL蟲草菌液；實驗組 2給予 30 mmol／L D-葡萄糖 ＋10μg／mL蟲草菌液；實驗組 3給予30mmol／L D-葡萄糖 ＋20μg／mL蟲草菌液。檢測各組細胞內(nèi)E-鈣粘蛋白（E-Cadherin），纖連蛋白（fibrous protein，F(xiàn)N），α-平滑肌肌動蛋白（a-smooth muscle actin，α-SMA）及整合素連接激酶（Integrin Linked Kinase，ILK）蛋白的表達。結(jié)果與對照組相比，高糖組E-cadherin蛋白表達顯著降低（P＜0.01），且隨著蟲草菌液加入的量升高，E-cadherin蛋白表達也逐漸升高（均P＜0.01）。與對照組相比，高糖組α-SMA蛋白和FN蛋白表達均顯著升高（P＜0.01），且2蛋白在實驗組2和實驗組3中表達均較高糖組顯著下降（均P＜0.01）。與對照組相比，高糖組ILK蛋白表達顯著升高（P＜0.01），實驗組3 ILK蛋白表達較高糖組顯著下降（P＜0.01）。結(jié)論蟲草菌液能夠抑制腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制腎小管間質(zhì)纖維化。

蟲草菌液；糖尿病腎??；腎小管上皮細胞

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 試驗細胞為人腎小管上皮細胞（中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司）。主要儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱（BOI-50，上海三騰儀器有限公司），96孔細胞培養(yǎng)板（北京萌壯科技），低速離心機（JK-CTL-TD5A，上海精學科學儀器有限公司），微量離心機（Mini-6K，北京博瑞祥騰科技有限公司），酶標分析儀（DNM-9602型，北京普朗），恒溫水浴槽（5000-V20-HT90，杭州儀華儀器）。主要試劑：胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司），胰蛋白酶（北京格源天潤生物技術(shù)有限公司）；D-葡萄糖（云南白藥，國藥準字 H53021483），D-甘露醇（廣州遠東藥業(yè)，國藥準字H44022709），蟲草菌液（杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字Z10910037），小鼠GAPDH單克隆抗體（艾美捷科有限公司），小鼠抗人纖維連結(jié)蛋白單克隆抗體（艾美捷科有限公司），小鼠抗人E-Cadherin單克隆抗體（艾美捷科有限公司），兔抗人整合素連接激酶多克隆抗體（艾美捷科有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代：人腎小管上皮細胞采用含10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，5%CO2，每2～3 d換液1次。鏡下觀察細胞融合度達80～90%時，用0.2%的胰蛋白酶溶液消化傳代。細胞傳代：棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加D-Hanks液2mL，晃動沖洗瓶底，洗去殘留的胎牛血清；棄去D-Hanks液，加入0.2%的胰蛋白酶進行消化，將消化后的細胞分別裝入2個培養(yǎng)瓶，加入新培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理和分組：選擇蟲草菌液的劑量為分別為5、10、20μg／mL。根據(jù)加入劑量不同分成以下 5組：對照組含5.5mmol／L D-葡萄糖，高糖組含 30 mmol／L D-葡萄糖，實驗組 1含 30 mmol／L D-葡萄糖和 5μg／mL蟲草菌液，實驗組 2含30mmol／L D-葡萄糖和 10μg／mL蟲草菌液，實驗組 3含30mmol／L D-葡萄糖和20μg／mL蟲草菌液。

1.3 Western Blot檢測 藥物作用48 h后收集細胞，提取細胞總蛋白。吸干培養(yǎng)液，加入4℃存放的PBS液3 mL洗滌3次，加400μL PMSF裂解液，12 000 r／min離心 15min，去上清用于蛋白含量測定，蛋白含量測定方法Bio-Rad DC protein assay。采用Western Blot檢測細胞 E-Cadherin、FN、α-SMA及ILK蛋白表達情況，采用Bio Rad quantity one軟件分析信號強度，蛋白相對表達量＝目的蛋白灰度值／內(nèi)參照灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0進行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)計量資料用“±s”表示，采用F檢驗和t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎小管上皮細胞E-cadherin蛋白表達情況 與對照組相比，高糖組E-cadherin蛋白表達顯著降低（P＜0.01），且隨著加入蟲草菌液的量升高，E-cadherin蛋白表達也逐漸升高（見表1、圖1）。

表1 各組E-cadherin蛋白表達情況Tab.1 E-cadherin expression in all groups

圖1 各組E-cadherin蛋白表達結(jié)果1.對照組；2.高糖組；3.實驗組1；4.實驗組2；5.實驗組3Fig.1 Expression of E-cadherin pritein in each group1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

2.2 各組α-SMA蛋白表達情況 高糖組α-SMA蛋白表達顯著升高，蟲草菌液的量為10μg／mL和20μg／mL組α-SMA蛋白表達較高糖組顯著下降（P＜0.01，見表2）。

表2 各組α-SMA蛋白表達情況Tab.2 α-SMA expression of all groups

圖2 各組α-SMA蛋白表達western blot結(jié)果1.對照組；2.高糖組；3.實驗組1；4.實驗組2；5.實驗組3Fig.2 Western blot results ofα-SMA expression of all groups1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

2.3 各組FN蛋白的表達 高糖組FN蛋白表達顯著升高，蟲草菌液的量為10μg／mL和20μg／mL組FN蛋白表達較高糖組顯著下降（P均＜0.01，見表3）。

表3 各組FN蛋白的表達Tab.3 FN expression of all groups

2.4 各組ILK蛋白表達情況 高糖組ILK蛋白表達顯著升高，蟲草菌液的量為20μg／mL組ILK蛋白表達較高糖組顯著下降（P＜0.01，見表4）。

圖3 各組FN蛋白表達蛋白表達western blot結(jié)果1.對照組；2.高糖組；3.實驗組1；4.實驗組2；5.實驗組3Fig.3 Western blot results of FN expression in all groups1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

表4 各組ILK蛋白表達情況Tab.4 ILK expression in all groups

圖4 各組ILK蛋白表達蛋白表達western blot結(jié)果1.對照組；2.高糖組；3.實驗組1；4.實驗組2；5.實驗組3Fig.4 Western blot Results of ILK expression of all groups1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者重要的合并癥，在我國糖尿病腎病的發(fā)病率呈上升趨勢，已經(jīng)成為終末期腎臟病的第二位原因，僅次于腎小球腎炎。因糖尿病腎病存在復雜的代謝紊亂，一旦發(fā)展為終末期腎病，比其他腎臟疾病的治療更棘手，因此防治的意義更加重要。糖尿病腎病的發(fā)病機制主要是高血糖導致腎臟血流動力學發(fā)生改變以及糖代謝異常，從而導致腎臟損傷。腎組織局部的糖代謝紊亂，通過非酶糖基化形成糖基化終末代謝產(chǎn)物，激活多元醇通路，進一步激活二?；视?蛋白激酶C途徑，導致已糖胺通路代謝異常。這些改變參與了早期的高濾過，促進腎小球基底膜增厚和細胞外基質(zhì)蓄積。細胞外基質(zhì)的蓄積導致腎間質(zhì)纖維化，包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原纖維，F(xiàn)N（纖維連接蛋白），層粘連蛋白及骨橋素等。細胞外基質(zhì)主要由肌成纖維細胞產(chǎn)生，在病理情況下，間質(zhì)成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、循環(huán)中的單核細胞以及腎小管上皮細胞等均可被激活而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞［5-6］。

冬蟲夏草是一種傳統(tǒng)的藥材，冬蟲夏草中82.2%為不飽和脂肪酸，此外，尚含有維生素B12、麥角脂醇、六碳糖醇、多種生物堿等，主要活性成分是蟲草素，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗疲勞等效果，蟲草素對小鼠腫瘤細胞的增殖具有強抑制作用，其滲入到RNA中，在細胞內(nèi)磷酸化為3'-ATP，導致mRNA吸收和成熟障礙，而達到抑制腫瘤的作用［7-8］?，F(xiàn)代醫(yī)學臨床研究表明，冬蟲夏草吞噬腫瘤細胞的能力是硒的4倍，冬蟲夏草所含蟲草素能明顯增強紅細胞粘附腫瘤細胞的能力，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；能明顯提升白血球和血小板數(shù)量，迅速改善放化療后的嘔吐惡心、胃口差、頭發(fā)脫落、失眠等癥狀［9］。研究顯示冬蟲夏草能夠抑制糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化過程［10］。

鈣粘素（cadherin）屬親同性CAM，其作用依賴于Ca2＋。至今已鑒定出30種以上鈣粘素，分布于不同的組織。E-鈣粘素主要集中在著床前的胚胎、上皮細胞（在帶狀粘合處特別集中）［11］。因此本研究通過測定腎小管上皮細胞E-鈣粘素情況來判斷細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化情況。結(jié)果顯示高血糖素腎小管上皮細胞E-鈣粘素的表達顯著下降（P＜0.01），說明具有腎小管上皮細胞特征的細胞顯著下降。而加入蟲草菌液后，E-鈣粘素的表達較高糖組有所升高，并且隨著加入量的增加，升高程度也越來越高。α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是肌成纖維細胞的標志蛋白之一［12］。在本次實驗中，高糖組α-SMA的表達顯著升高，提示高血糖能夠誘導腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。而隨著加入的蟲草菌液量的增加，α-SMA顯著下降（P＜0.01）。研究顯示，在健康人的腎臟間質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)表達α-SMA的肌成纖維細胞，而糖尿病腎病患者腎小管間質(zhì)區(qū)域α-SMA表達增加。纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）是1974年國外開始研究發(fā)現(xiàn)的一種高分子糖蛋白，具有多種生物學功能，是腎間質(zhì)纖維化的主要成分之一［13］。在本次實驗中，與對照組比較，高糖組細胞中FN蛋白的表達顯著升高。但是加入蟲草菌液后，F(xiàn)N蛋白的表達有所下降，尤其是濃度為10μg／mL和20μg／mL組（實驗組2和實驗組3），與高糖組比較，有顯著下降。整合素連接激酶（ILK）是一種新發(fā)現(xiàn)的Ser／Thr（絲氨酸／蘇氨酸）蛋白激酶，通過與整合素β1亞單位結(jié)合從而介導細胞與胞外基質(zhì)的連接，以依賴于PI3K的方式激活，并通過磷酸化下游底物PKB／AKT、GSK3等使胞外信號得以向下游傳遞，對細胞的生長、分化、遷移等進行調(diào)控［14］。ILK具有多種蛋白激酶活性，參與細胞粘附、基因表達、細胞外基質(zhì)沉積等過程。研究顯示其參與了TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化過程中的多個關(guān)鍵步驟，是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一［15］。在本次實驗中，高糖組ILK蛋白表達顯著升高，而加入蟲草菌液后，其表達有所下降，尤其是20 μg／mL組（實驗組3）較高糖組顯著下降。

綜上所述，蟲草菌液能夠增加高糖作用下腎小管上皮細胞E-鈣粘素的表達，降低其α-SMA、FN、ILK的表達，提示其具有抑制腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制腎小管間質(zhì)纖維化的過程。

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（編校：吳茜）

Effect of Cordyceps sinensis liquid on diabetic nephropathy renal tubular epithelial cell transdifferentiation

LIU Tong-wei，ZHOU Dun，HAO Chun-yan

（Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Colleage，Jingzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of Cordyceps sinensis liquid on Diabetic Nephropathy renal tubular epithelial cell transdifferentiation.MethodsDiabetic Nephropathy renal tubular epithelial cells were treated with different dose of Cordyceps sinensis liquid and high glucose，and divided into five groups.Control group was added 5.5 mmol／L D-glucose，High glucose group was added 30 mmol／L D-glucose，Experimental group 1 was added 30mmol／L D-glucose and 5μg／mL Cordyceps sinensis liquid，Experimental group 2 was added 30 mmol／L D-glucose and 10μg／mL Cordyceps sinensis liquid，Experimental group 3 was added 30 mmol／L D-glucose and 20μg／mL Cordyceps sinensis liquid.The expression of E-cadherin protein，F(xiàn)N protein，α-SMA protein and ILK protein in each group were detected by western blot.ResultsCompared with control group，the expression of E-cadherin protein in high glucose was decreased significantly（P＜0.01），and with the addition of Cordyceps bacteria increases，E-cadherin protein expression in three Experimentgroup were gradually increased（P＜0.01）.Compared with control group，the expression of α-SMA protein and FN protein in High glucose group were increased significantly（P＜0.01），and both two protein in Experiment group 2 and Experiment3 were significantly lower than High glucose group（P＜0.01）.Compared with control group，the expression of ILK protein in high glucose group was significantly higher（P＜0.01），and its expression in Experiment group 3 was significantly lower than High glucose group（P＜0.01）.ConclusionCordyceps sinensis liquid can inhibit diabetic nephropathy renal tubular epithelial cell translating into myofibroblast，then inhibit renal tubule interstitial fibrosis.

Cordyceps sinensis liquid；diabetic nephropathy；renal tubular epithelial cell

R285.5

A

1005－1678（2014）04－0047－04

糖尿病腎病是2型糖尿病常見的合并癥，隨著糖尿病發(fā)病率的上升，其發(fā)生率也呈上升趨勢，且成為終末期腎病的主要原因。腎小管間質(zhì)病變是糖尿病腎病的重要病理改變，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的過量堆積［1-2］。病理情況下腎小管上皮細胞能夠轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞是產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的主要細胞［3-4］。本研究通過將高糖及不同濃度的蟲草菌液作用于體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞，測定上皮細胞表型特征、肌成纖維細胞表型特征等蛋白，旨在觀察蟲草菌液在腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中的作用。

遼寧省科技廳課題（201101575）

劉彤崴，女，本科，中級，研究方向：腎病內(nèi)科，E-mail：2912878480＠qq.com。