韓婧，張朝杰，張程，路蘋，歐陽章宏，張湘燕

（貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550002）

甲潑尼龍琥珀酸鈉對自身免疫性肺氣腫大鼠肺泡隔細胞凋亡的影響

韓婧，張朝杰，張程，路蘋，歐陽章宏?，張湘燕?

（貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550002）

目的探討甲潑尼龍琥珀酸鈉對自身免疫性肺氣腫大鼠肺泡隔細胞凋亡的影響及作用機制，為研究慢性阻塞肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)病機制及尋求新的治療方法提供理論依據(jù)。方法24只SD大鼠隨機分為3組：佐劑對照組（n＝8）、自身免疫性肺氣腫模型組（簡稱模型組，n＝8）及甲潑尼龍琥珀酸鈉干預(yù)組（簡稱干預(yù)組，n＝8）。將原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞及佐劑注入模型組大鼠腹腔內(nèi)建立自身免疫性肺氣腫模型，干預(yù)組同時腹腔內(nèi)注入注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉10mg／（kg·d）的劑量進行干預(yù)。佐劑對照組腹腔內(nèi)只注射等量的佐劑。21 d后處死所有大鼠。每組均取肺組織切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色觀察病理形態(tài)學(xué)改變，并定量測定肺平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）、平均肺泡數(shù)（mean alveolar numbers，MAN），利用免疫組化法測定血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子-2（vascular endothelial growth factor-recptor2，VEGFR-2）在肺內(nèi)的表達；采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP缺口末端標(biāo)記Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling，TUNEL）技術(shù)檢測肺泡隔細胞調(diào)亡。結(jié)果模型組MLI比佐劑對照組明顯增高（P＜0.05），但MAN比佐劑對照組明顯降低（P＜0.05）；干預(yù)組MLI比模型組明顯降低（P＜0.05），但MAN比模型組明顯增高（P＜0.05）。模型組肺內(nèi)VEGF、VEGFR-2的表達較佐劑對照組明顯降低，干預(yù)組肺內(nèi)VEGF、VEGFR-2的表達較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組肺泡間隔細胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）明顯高于佐劑對照組；干預(yù)組AI低于模型組，但高于佐劑對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論肺組織內(nèi)VEGF、VEGFR-2表達下降可能通過促進肺泡隔細胞凋亡，參與大鼠自身免疫性肺氣腫的形成；甲潑尼龍琥珀酸鈉可緩解自身免疫性肺氣腫的形成，其機制可能與調(diào)控VEGF、VEGFR-2表達及抑制肺泡間隔細胞凋亡有關(guān)。

自身免疫性肺氣腫；VEGF；VEGFR-2；甲潑尼龍琥珀酸鈉；肺泡隔細胞凋亡

近年來，多項國內(nèi)外研究表明，自身免疫反應(yīng)可能參與慢性阻塞肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）發(fā)生、發(fā)展的過程。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCS）是治療炎癥紊亂和自身免疫性疾病經(jīng)常使用的免疫抑制之一［1-2］，但該藥對自身免疫性肺氣腫是否同樣有效，目前國內(nèi)外尚無系統(tǒng)研究。鑒于諸多文獻［3-7］研究均表明血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子-2（vascular endothelial growth factor-recptor 2，VEGFR-2）表達下降有可能加劇肺部內(nèi)皮細胞的凋亡，從而促進肺氣腫的形成。本實驗通過建立自身免疫性肺氣腫模型，參照甲潑尼龍琥珀酸鈉干預(yù)吸煙肺氣腫的效果最佳量［8］進行干預(yù)，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變、肺內(nèi)VEGF、VEGFR-2表達及肺泡隔細胞凋亡等情況，旨在探討糖皮質(zhì)激素對自身免疫性肺氣腫的干預(yù)效果及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 VEGF免疫組化試劑盒來自美國Peprotech公司；TUNEL試劑盒為德國Roche公司產(chǎn)品。新生兒臍帶來源于貴州省人民醫(yī)院健康足月妊娠分娩產(chǎn)婦，征得患者家屬同意簽署知情同意書，并上報貴州省人民醫(yī)院倫理委員會備案。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉瓶裝40mg（Pfizer Manufacturing Belgium NV）。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng) 參照阮溦等［9］研究方法，進行人臍靜脈內(nèi)皮細胞改良分離、培養(yǎng)：結(jié)扎臍帶，反復(fù)沖洗臍帶內(nèi)殘留的紅細胞，用0.1%Ⅱ型膠原酶注向臍帶靜脈，回抽含有臍靜脈內(nèi)皮細胞的膠原酶懸浮液，離心后取試管底部沉積細胞，進行細胞培養(yǎng)。約3～5 d后，顯微鏡下見臍靜脈內(nèi)皮細胞融合成單層后立即傳代。人臍靜脈內(nèi)皮細胞鑒定參照晏木云［10］實驗方法進行。

1.3 實驗動物及分組處理 健康清潔級雄性SD（Sprague Dawley）大鼠24只，鼠齡10周，體質(zhì)量200～280 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心有償提供［許可證號：SCXK（黔）2012-001，NO：0201552］。實驗室自然光照，通風(fēng)良好，室溫保持在20℃ ～25℃。大鼠自由攝食、飲水。全飼料營養(yǎng)由該動物實驗室提供。隨機將大鼠分為自身免疫性肺氣腫模型組（簡稱模型組，n＝8）、甲潑尼龍琥珀酸鈉干預(yù)組（簡稱干預(yù)組，n＝8）、佐劑對照組（n＝8）共3組。模型組參照國外文獻［11］實驗方法建立自身免疫肺氣腫模型：取4～6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞1×107，加入完全弗氏佐劑1mL混懸液，注射到大鼠腹腔內(nèi)。干預(yù)組在模型組基礎(chǔ)上給予甲潑尼龍琥珀酸鈉10mg／（kg·d）的劑量［8］干預(yù)。佐劑對照組僅給予腹腔內(nèi)注射完全弗式佐劑1 mL。各組經(jīng)上述相應(yīng)處理后，在實驗室繼續(xù)飼養(yǎng)。21 d后處死所有大鼠進行如下檢測。

1.4 制作大鼠肺組織病理切片及形態(tài)學(xué)分析 結(jié)扎左肺，將4%多聚甲醛灌注右肺，右肺胸膜展平，肺組織邊緣變鈍，大約持續(xù)30min。取右肺下葉浸入4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色的肺組織。按照相關(guān)文獻所敘述的方法測量肺平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）、平均肺泡數(shù)（mean alveolar numbers，MAN）［12］。

1.5 肺組織VEGF、VEGFR-2免疫組化檢測 參照試劑盒說明書進行檢測。VEGF、VEGFR-2陽性染色為棕黃色或棕褐色顆粒，定位為在肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞的胞漿，小血管內(nèi)皮細胞可見少許陽性染色細胞漿。每張切片隨機選取3個視野，計算每個視野中免疫組化陽性染色細胞的面積與肺組織的面積百分比。

1.6 肺泡間隔的細胞凋亡測定 采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling，TUNEL）技術(shù)對肺泡隔調(diào)亡細胞檢測，按照試劑盒說明書進行操作。光鏡下觀察，細胞核染色為棕褐色者為陽性細胞。參照晏木云［10］所描述的的方法計算肺泡隔細胞凋亡指數(shù)：每例隨機記數(shù)5個高倍視野（×400），計算100個肺泡隔細胞中陽性細胞數(shù)目作為凋亡指數(shù)（apototic index，AI）。凋亡指數(shù)＝凋亡的肺泡隔細胞數(shù)目／肺泡隔細胞總數(shù)目×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 以統(tǒng)計軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行分析。正態(tài)計量資料以“±s”表示。3組之間方差齊時，采用方差分析；當(dāng)3組之間方差不齊時，采用秩和檢驗（Kruskal-Wallis）。各組間的兩兩比較采用q檢驗或Nemenyi法秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化 佐劑對照組大鼠氣道管壁結(jié)構(gòu)正常，肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡間隔完整，見少量炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織可見較多炎細胞浸潤，肺泡間隔變薄，部分肺泡腔破裂，相互融合擴大，呈肺氣腫樣病理學(xué)改變。干預(yù)組上述病理變化相對較輕（見圖1）。模型組與正常對照組、干預(yù)組比較，MLI明顯升高，而MAN顯著降低（P＜0.05），表明自身免疫性肺氣腫大鼠模型建立成功（見表1）。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×100）Fig.1 Comparison of the lung tissue HE staining result in each group（×100）

表1 各組大鼠MLI、MAN比較Tab.1 Comparison of the MLIand MAN in each group

2.2 3組大鼠肺組織免疫組化染色結(jié)果比較 模型組肺內(nèi)VEGF、VEGFR-2比佐劑對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組VEGF、VEGFR-2比模型組增高，比佐劑對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2、圖2）。

表2 各組大鼠VEGF、VRGFR-2比較Tab.2 Comparison of the VEGF and VRGFR-2 in each group

圖2 各組大鼠VEGF及其受體2（VEGFR-2）免疫組化染色結(jié)果比較（×400）Fig.2 Comparison of the VEGF and its receptor 2（VEGFR-2）immunohistochemical staining results in each group（×400）

2.3 各組大鼠肺泡間隔細胞凋亡指數(shù)（AI）比較 模型組肺泡隔細胞AI比正常對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組肺泡隔細胞AI比降模型組明顯低，比正常對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3、圖3）。

表3 各組大鼠肺泡間隔細胞凋亡指數(shù)（AI）比較Tab.3 Comparison of the alveolar interval apoptosis index in each group

圖3 各組大鼠肺泡間隔細胞凋亡指數(shù)（AI）比較（×400）Fig.3 Comparison of the alveolar interval apoptosis index in each group（×400）

3 討論

在本實驗中，模型組中的MLI較正常組明顯增高，而MAN顯著下降（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。病理學(xué)切片結(jié)果顯示肺組織肺泡間隔變薄，肺泡壁破壞，肺泡腔擴大等肺氣腫樣病理學(xué)改變，與Motz GT等［13］的研究結(jié)果相一致，提示自身免疫性肺氣腫模型成功復(fù)制建立。模型組大鼠肺組織內(nèi)的VEGF及VEGFR-2陽性染色細胞面積百分比明顯低于正常對照組（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時伴有凋亡指數(shù)的升高，與晏木云等［14］研究結(jié)果一致，提示VEGF、VEGFR-2的表達下降有可能誘發(fā)肺泡間隔細胞凋亡，從而參與自身免疫性肺氣腫形成。

糖皮質(zhì)激素對自身免疫性肺氣腫作用如何，目前國內(nèi)外尚無系統(tǒng)研究。本研究率先在國內(nèi)使用甲潑尼龍琥珀酸鈉對自身免疫性肺氣腫大鼠進行干預(yù)，參照李莉等［8］研究以10mg／（kg·d）甲潑尼龍琥珀酸鈉為最佳劑量干預(yù)被動吸煙大鼠，結(jié)果顯示應(yīng)用甲潑尼龍琥珀酸鈉干預(yù)后，大鼠肺內(nèi)VEGF及VEGFR-2顯著增加（均P＜0.05），同時伴有肺泡間隔細胞數(shù)目減少，提示使用糖皮質(zhì)激素有可能抑制VEGF及VEGFR-2的過度減少，從而降低肺泡間隔細胞的凋亡。結(jié)合相關(guān)文獻［10，15-16］提示以CD4＋T淋巴細胞為主介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在肺氣腫形成中起到關(guān)鍵性的作用，因此推測糖皮質(zhì)激素有可能阻斷以CD4＋T淋巴細胞為主的致敏細胞引起的免疫反應(yīng)從而抑制肺內(nèi)VEGF及VEGFR-2的過度減少，減少肺泡間隔細胞凋亡，抑制肺氣腫形成和發(fā)揮其療效。

綜上所述，甲潑尼龍琥珀酸鈉可能通過抑制VEGF、VEGFR-2的過度減少，降低肺泡間隔細胞凋亡，部分抑制自身免疫因素引起的肺氣腫，從而發(fā)揮其可能的療效，因此值得在臨床上進一步推廣使用，尤其適用于自身免疫反應(yīng)比較明顯的患者治療。但糖皮質(zhì)激素有可能調(diào)節(jié)自身免疫性肺氣腫CD4＋T淋巴細胞的機制，目前尚不清楚，值得進一步研究探討，且本實驗是以大鼠為研究對象，樣本量也比較小，有一定的局限性，待條件成熟時還需進行針對人的臨床試驗進行驗證。

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（編校：吳茜）

Effects ofmethylprednislone on alveola septal apoptosis in autoimmune emphysema rats

HAN Jing，ZHANG Chao-jie，ZHANG Cheng，LU ping，OUYANG Zhang-hong，ZHANG xiang-yan

（Departmant of Reqiratory and Critical Care Medichine，People's hospital of Guizhou，Guiyang 550002，China）

ObjectiveTo investigate the effects of methyprednislone on the expression of tumor alveolar septal cell apoptosis in autoimmune emphysema rats，in order to provide a theoretical basis for Chronic obstructive pulmonary disease（COPD）pathogenesis and it's treatment.Methods24 ratswere randomly divided into three groups：normal control group（n＝8），model group（n＝8）and intervention group（methylprednisolone sodium succinate，n＝8）.Intraperitoneal injection of primary cultured human umbilical vein endothelial cellswere given to establish the autoimmune emphysema models，intervention group was injected with methylprednisolone at the meantime，and normal control group was received adjuvant only.Pathological changeswere observed in lung tissues stained by hematoxylin eosin，mean liner intercept（MLI）and mean alveolar numbers（MAN）were measured.The localization of VEGF and VEGFR-2 in lung tissueswere detected by immunohistochemical analysis.Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）technique was carried out to detect the alveolar septal cells apoptosis.ResultsThe MLI inmodel group was higher than that in normal control group，while MAN was lower（P＜0.05）；MLI in intervention group was lower than that in model group，but the MAN was higher（P＜0.05）.The localization of VEGF and VEGFR-2 in lung tissues in model group were lower than that in normal control group，and those in intervention group were higher than that in model group，the difference were all statistically significant（P＜0.05）.AI of alveolar septal cell in modelgroup was higher than that in normal control group，which in intervention group was higher than that in model group，the difference were all statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe decreasing of VEGF and VEGFR-2 in lung tissuesmay cause alveolar septal cell apoptosis and contribute to the pathogenesis of autoimmune emphysema of rats.Methyprednislone can alleviate the form of autoimmune emphysema in rats，which may be ralated to the regulation of VEGF and VEGFR-2 expression and inhibition of alveolar septal cell apoptosis.

autoimmune emphysema；VEGF；VEGFR-2；methyprednislone；alveolar septal cell apoptosis

R56

A

1005－1678（2014）04－0036－04

貴州省科技廳和貴州省人民醫(yī)院聯(lián)合基金［SY（2010）3120］；國家自然基金資助項目（81060006）；“十二五”國家科技支撐計劃課題（2013BAI09B09）

韓婧，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：COPD基礎(chǔ)與臨床，E-mail：copdgy＠126.com；歐陽章宏，通信作者，男，本科，教授，研究方向：COPD基礎(chǔ)與臨床，E-mail：ouyangzhanghong＠163.com；張湘燕，并列通信作者，女，碩士，教授，研究方向：COPD基礎(chǔ)與臨床，E-mail：zxy35762＠126.com。