郭哲，劉濤燕，潘瑞遠，覃筱燕Δ

（1.中央民族大學 北京市食品環(huán)境與健康工程技術研究中心，北京 100081；2.廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 急診科，廣西 南寧 530021；3.中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081）

熱休克蛋白70在Curcum in抑制STS介導的神經(jīng)元毒性損傷中的作用

郭哲1，2，劉濤燕1，3，潘瑞遠1，3，覃筱燕1，3Δ

（1.中央民族大學 北京市食品環(huán)境與健康工程技術研究中心，北京 100081；2.廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 急診科，廣西 南寧 530021；3.中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081）

目的探討HSP70表達在姜黃素（Curcumin）預處理抑制星形孢菌素（Staurosporine，STS）介導的神經(jīng)元毒性應激損傷中的作用。方法采用SD大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細胞，STS誘導建立神經(jīng)細胞毒性應激損傷模型，在培養(yǎng)基中加入槲皮素（Quercetin）阻斷熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）表達。將細胞按添加藥物的不同分成以下6組：正常對照組、STS模型組、Quercetin＋STS模型組、Curcumin＋STS預處理組、Curcumin＋Quercetin＋STS處理組、Curcumin組。采用噻唑藍（MTT）法測定各組細胞活性，通過檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放率研究各組對細胞的毒性作用，Western Blot法檢測各組HPS70表達情況。結果MTT結果顯示Curcumin＋STS預處理組的細胞活性比STS模型組細胞活性明顯升高（P＜0.001）；與Quercetin＋STS模型組相比，Curcumin＋quercetin＋STS處理組的細胞活性無明顯變化。LDH結果顯示Curcumin＋STS預處理組的神經(jīng)細胞毒性明顯小于STS模型組（P＜0.001）。Western Blot結果顯示，與STS模型組相比，Curcumin＋STS預處理組HSP70蛋白表達量明顯增加（P＜0.001）。結論Curcumin可通過上調(diào)HSP70的表達抑制STS介導的神經(jīng)元毒性應激損傷；當加入Quercetin阻斷神經(jīng)細胞HSP70的表達后，Curcumin抑制STS介導的神經(jīng)元毒性應激損傷作用被抵消。

Curcumin；星形孢菌素（STS）；海馬神經(jīng)元；HSP70；槲皮素

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）又稱為應激蛋白，是在高熱、缺血、缺氧和其他應激條件下由變性蛋白誘導產(chǎn)生的，它與細胞的許多生理、病理過程密切相關［1］。在 HSP家族中，HSP70是在所有生物細胞中發(fā)現(xiàn)對應激條件最敏感也是功能最重要的一類熱休克蛋白［2］，它通過“分子伴侶”作用廣泛參與細胞周期控制、分化和凋亡等生理功能的調(diào)節(jié)［3］。

本實驗室前期研究表明，姜黃素（Curcumin）可通過抑制細胞活性氧（ROS）的釋放、下調(diào)Active-Caspase-3和上調(diào)p-AKT蛋白表達發(fā)揮對星形孢菌素（staurosporine，STS）所致大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用［4］。為進一步闡明Curcumin對神經(jīng)元損傷的保護作用機制及其與應激蛋白HSP70的關系，本研究在STS誘導建立大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元毒性應激損傷模型的基礎上，通過給予Curcumin和HSP70阻斷劑槲皮素（Quercetin）預處理考察了HSP70表達量的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：1日齡SD大鼠乳鼠，由北京大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。合格證號：SCXK（京）2005-0013。

1.1.2 藥物和試劑：Curcumin、槲皮素（Quercetin）、STS、MTT、多聚賴氨酸和阿糖胞苷購自美國Sigma公司。LDH購自美國Promega公司。Hsp-70一抗購自美國Santa Cruz公司。胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、B27、胎牛血清、HEPES、青霉素和鏈霉素均購自美國 Invitrogen公司。Tris-buffered saline Tween-20（TBST）、二甲基亞楓（DMSO）等試劑均為國產(chǎn)市售分析純。實驗時將Curcumin或Quercetin溶于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中，終濃度分別為 10μmol／L，20μmol／L。STS使用終濃度為20μmol／L。

1.1.3 儀器：CK2-倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本 Sanyo公司）；22R冷凍高速離心機（德國Heraeus公司）；sunrise酶標儀（澳大利亞Tecan公司）；DM-R型多功能顯微鏡及測量系統(tǒng)（德國Leica公司）；BH-2型熒光顯微鏡及攝影系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠海馬神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)及分組處理：無菌條件下取新生SD大鼠乳鼠腦，分離出海馬組織并剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，吹打分散過濾細胞。用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液制成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)至1×106個／mL，將細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。第3天換用含1%阿糖胞苷和5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液抑制雜細胞生長，每隔3 d換液1次，細胞培養(yǎng)至7 d時供實驗用。顯微鏡觀察神經(jīng)細胞形態(tài)變化。實驗設6組：正常對照組、STS模型組、Quercetin＋STS模型組、Curcumin＋STS預處理組、Curcumin＋Quercetin＋STS處理組、Curcumin組。正常對照組整個培養(yǎng)過程不加入任何處理因素；細胞培養(yǎng)至第7天時，STS模型組加入終濃度為20μmol／L的STS制備細胞損傷模型；Quercetin＋STS模型組先加入終濃度為10μmol／L的Quercetin培養(yǎng)1 h后再加入20μmol／L的STS以制備細胞損傷模型；Curcumin＋STS預處理組同時加入終濃度均為 20μmol／L的 Curcumin和 STS；Curcumin＋Quercetin＋STS處理組先加入終濃度為10μmol／L的Quercetin培養(yǎng)1 h后，同時加入終濃度均20μmol／L的Curcumin和STS；Curcumin組不作STS損傷，只加入Curcumin使終濃度為20μmol／L。各組細胞處理后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后用于實驗觀察。96孔板細胞用于測定MTT、LDH，6孔板細胞用于Western Blot檢測。

1.2.2 細胞活性檢測：細胞孵育24 h后，每孔加入終濃度為0.5mg／m L的 MTT 10μL，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光繼續(xù)孵育24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO液150μL，室溫下置于搖床上振蕩15 min，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，用酶標儀在570 nm處測定各孔吸光度（A）值。

1.2.3 細胞毒性損傷檢測：細胞孵育24 h后，每孔取出培養(yǎng)基50μL，測定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶釋放量，該指標可反映細胞毒性損傷程度。按照LDH試劑盒說明書進行檢測，細胞毒性計算：%細胞毒性＝釋放到培養(yǎng)基中LDH／（釋放到培養(yǎng)基中的LDH＋胞內(nèi)LDH）。

1.2.4 HSP70表達檢測：取1.2.1中4組細胞，采用6孔板培養(yǎng)，1周后分組收集蛋白樣品，Western Blot檢測。取適量蛋白上樣，SDS-PAGE電泳（分離膠濃度為10%、1×濃縮膠）后轉膜（PVDF膜），用封閉液封閉30min，一抗（HSP70抗體稀釋濃度為1∶1000）孵育過夜，TBST洗滌3～5次，用稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗搖床孵育1 h，洗滌3～5次后進行顯影，檢測目的蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行獨立性t檢驗，實驗數(shù)據(jù)用“±s”表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Curcumin對STS介導的乳鼠海馬神經(jīng)元損傷細胞存活率的影響 MTT試驗結果顯示：與正常對照組比較，STS模型組乳鼠海馬神經(jīng)元細胞存活率明顯下降了40%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，見圖1），表明造模成功。Curcumin預處理組較模型組神經(jīng)元存活率明顯提高（P＜0.001）；Curcumin組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。說明終濃度為20μmol／L的Curcumin能抑制STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元毒性損傷。

圖1 Curcumin對STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元損傷存活率的影響***P＜0.001，與對照組相比；＃＃＃P＜0.001，與 STS模型組相比Fig.1 Effect of Curcumin on cell viability of STS-mediated rats hippocampal damage neurons***P＜0.001，compared with control group；＃＃＃P＜0.001，compared with the STSmodel group

2.2 Curcumin對STS介導的乳鼠海馬神經(jīng)元LDH釋放率的影響 LDH法檢測結果顯示：與正常對照組比較，STS模型組的神經(jīng)細胞毒性率明顯增大（P＜0.001）。與STS模型組比較，Curcumin＋STS預處理組神經(jīng)細胞的毒性率明顯降低，（P＜0.01，見圖2）。說明Curcumin能降低STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元毒性損傷。

圖2 Curcumin對STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元毒性損傷的LDH釋放率的影響***P＜0.001，與對照組比較；＃＃＃P＜0.001，與 STS模型組比較Fig.2 Effect of Curcumin on LDH release in STS-mediated rats hippocampal damage neurons***P＜0.001，compared with control group；＃＃＃P＜0.001，compared with the STSmodel group

2.3 Curcumin對STS介導的乳鼠海馬神經(jīng)元毒性應激損傷中細胞HSP70表達量變化 Western Blot檢測結果顯示：與正常對照組比較，STS模型組細胞HSP70表達量顯著升高（P＜0.001），Curcumin組HSP70的表達無明顯變化。Curcumin＋STS預處理組與STS模型組比較有極顯著差異（P＜0.001，見圖3）。說明神經(jīng)細胞在STS毒性損傷的應激條件下增加了HSP70的表達量以對抗STS介導的應激損傷，而Curcumin可通過增加神經(jīng)細胞HSP70的表達抑制STS介導的神經(jīng)細胞應激損傷，從而起到細胞修復和保護作用。

圖3 Curcumin對STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)細胞損傷中HSP70表達量的影響**P＜0.01，與對照組比較；＃＃＃P＜0.001，與 STS模型組比較Fig.3 Effect of Curcumin on HSP70 expression in STS-mediated rats hippocampal damage neurons***P＜0.001，compared with control group；＃＃＃P＜0.001，compared with the STSmodel group

2.4 加入HSP70阻斷劑Quercetin后Curcumin對STS介導的乳鼠海馬神經(jīng)元應激損傷細胞存活率的影響 MTT法檢測結果顯示：與STS模型組比較，Curcumin＋STS預處理組神經(jīng)元存活率明顯提高（P＜0.001）；與 Quercetin＋STS模型組比較，Curcumin＋Quercetin＋STS預處理組神經(jīng)元存活率無明顯變化；與Curcumin＋STS模型組比較，Curcumin＋Quercetin＋STS預處理組神經(jīng)元存活率明顯降低（P＜0.001，見圖4）。由此可見加入Quercetin阻斷了神經(jīng)細胞HSP70的表達，Curcumin抑制STS介導的神經(jīng)元毒性損傷作用被抵消，表明Curcumin抑制STS介導的神經(jīng)元毒性損傷作用與Curcumin上調(diào)HSP70的表達有關。

圖4 加入HSP70阻斷劑Quercetin后Curcumin對STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元損傷存活率的影響***P＜0.001，與 STS模型組比較；＃＃＃P＜0.001，與 Curcumin＋STS模型組比較Fig.4 Effect of Curcumin on cell viability in STS-mediated rats hippocampal damage neurons after added HSP70 blocker Quercetin***P＜0.001，compared with control group；＃＃＃P＜0.001，compared with the STSmodel group

3 討論

星形孢菌素（Staurospurine，STS）作為一種廣譜細胞凋亡誘導劑應用于各種細胞凋亡研究中，是一種常用、可靠的線粒體途徑細胞凋亡誘導劑［4-5］。姜黃素（Curcumin）是從草本植物姜黃（Curcuma longa Linn）的根莖中提取出來的酚類活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗凋亡、抗衰老等廣泛藥理作用［4，6］。本實驗室前期研究已經(jīng)表明，Curcumin可通過抑制細胞活性氧（ROS）釋放、下調(diào)Active-Caspase-3和上調(diào)p-AKT蛋白表達，從而發(fā)揮對STS所致大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用［4］。為進一步闡明Curcumin對神經(jīng)元損傷的保護作用機制及與應激蛋白HSP70的關系，本實驗繼續(xù)使用線粒體途徑的細胞凋亡誘導劑STS介導大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元應激損傷。MTT和LDH釋放量檢測結果均顯示STS介導的神經(jīng)細胞應激損傷模型與正常對照組相比細胞存活率下降了40%，細胞毒性增加，說明造模成功。

HSP70能在細胞色素C的釋放和Caspase起始活化2個水平影響凋亡通路，參與細胞凋亡的保護［7］。HSP70主要通過抑制凋亡級聯(lián)反應通路上游過程，如Caspase3，JNK和P38MAPK激酶的活性發(fā)揮抗凋亡作用［8］。當機體細胞在受到各種應激如高熱、氧化應激等刺激時，細胞應激誘發(fā)凋亡，同時積極調(diào)整保護機制，促進HSP70合成減輕應激損傷，增強細胞對應激損害的耐受程度，提高細胞的生存率［9］。在多種應激情況下，HSP70合成可增強應激細胞處理非折疊和／或變性蛋白的能力，因而增加了暴露于廣泛致死性刺激下細胞的存活［10］。轉染HSP70的細胞能對抗多種應激和凋亡劑誘導的細胞凋亡［11］。

缺血、創(chuàng)傷、氧化應激等均可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量表達HSP70［11］。HSP70被認為是損傷后腦組織產(chǎn)生的一種重要的內(nèi)源性保護因子［12-13］。本實驗Western Blot結果顯示：與正常對照組比較，STS損傷模型組的HSP70表達量明顯升高（P＜0.01），正常對照組和Curcumin組HSP70的表達無顯著差異，說明神經(jīng)細胞受到STS毒性應激損傷時，細胞促進了HSP70合成，增強了細胞對應激損害的耐受程度，從而維持神經(jīng)細胞的存活。Curcumin＋STS預處理組與STS毒性損傷模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），說明Curcumin緩解了STS介導的神經(jīng)細胞應激損傷。為進一步驗證Curcumin是否是通過增加神經(jīng)細胞的應激蛋白HSP70表達量來抑制STS介導的神經(jīng)細胞應激損傷，本實驗在細胞培養(yǎng)基中加入了HSP70阻斷劑Quercetin（終濃度為10μmol／L）。與Quercetin＋STS損傷模型組比較，Curcumin＋Quercetin＋STS預處理組神經(jīng)元存活率差異無顯著變化。說明Quercetin阻斷了神經(jīng)細胞HSP70的合成，Curcumin抑制STS介導的神經(jīng)元毒性應激損傷作用被取消，由此證明了Curcumin抑制STS介導的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元毒性應激損傷作用確與Curcumin上調(diào)HSP70表達有關。

綜上所述，本實驗結果表明Curcumin通過上調(diào)HSP70的表達來抑制STS介導的神經(jīng)元毒性應激損傷；添加Quercetin阻斷神經(jīng)細胞HSP70的表達后，Curcumin抑制STS介導的神經(jīng)元毒性應激損傷作用被取消。

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（編校：吳茜）

Effect of heat shock protein 70 expression in Curcum in's inhibition on STS-induced neurons injury

GUO Zhe1，2，LIU Tao-Yan1，3，PAN Rui-Yuan1，3，QIN Xiao-yan1，3Δ

（1.Beijing Engineering Research Center of Food environment and health，Minzu University of China，Beijing 100081，China；2.Emergency Department，The Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 53002，China；3.College of Life and Environmental Science，Minzu University of China，Beijing 100081，China）

ObjectiveTo explore the effect of heat shock protein 70（HSP70）expression in the role of Curcumin inhibited staurosporine（STS）-mediated neurons toxic injury.MethodsThe primary cultured hippocampal neurons was cultured in vitro and the stress damage model of STS-induced nerve cell toxicitywas established.The experimentwere divided into six groups according to the added drugs：normal control group，the STSmodel group（final concentration was 20μmol／L），Quercetin＋STSmodel group（final concentration were 10μmol／L and 20μmol／L，respectively），Curcumin＋STSpretreatmentgroup（for20μmol／L final concentration），Curcumin＋Quercetin＋STS treatmentgroup（final concentration were 20μmol／L，10μmol／L and 20μmol／L，respectively）and Curcumin treatment group（final concentration was 20μmol／L）.The cell viability were determined by thiazole blue（MTT）method，cell toxicity weremeasured by lactate dehydrogenase（LDH）release rate and HPS70 expression were detected by Western Blot.ResultsMTT results showed that the cell viability of Curcumin＋STS pretreatment group was significantly higher than STSmodel group（P＜0.001）.Compared with Quercetin＋STSmodel group，the cell viability of Curcumin＋Quercetin＋STS treatment group had little change.LDH results show that the nerve cell toxicity of Curcumin＋STSpretreatmentgroup was obviously less than thatof STSmodel group（P＜0.001）.Western Blot results show that compared with STSmodel group，HSP70 protein expression in Curcumin＋STS pretreatmentgroup was significantly increased（P＜0.001）.ConclusionCurcumin can inhibit STS-mediated neurons toxicity stress damage though increasing HSP70 expression，when added Quercetin to block HSP70 expression in nerve cells，the inhibiting effect of Curcumin on STS-mediated neuron toxic stress injury is counteract.

Curcumin；Staurosporine（STS）；Hippocampal neurons；heat shock protein 70；Quercetin

R996

A

1005－1678（2014）04－0024－04

中央高校自主科研基金（1112KYZY41）；中央民族大學985資助項目（MUC98504－14）

郭哲，男，醫(yī)學學士，研究方向：神經(jīng)損傷保護，E-mail：nnguozhe1975＠163.com；覃筱燕，通信作者，女，碩士，教授，研究方向：民族醫(yī)藥對肝損傷和神經(jīng)損傷保護相關性研究，E-mail：zhongsijia01＠163.com。