路璐，張俊伶，李德冠，孟愛民

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

瀘州市12所非基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)施基本藥物制度的成效分析…………………………………………………… 江啟蓉，馮碧敏（184）

芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用研究

路璐，張俊伶，李德冠，孟愛民

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

目的探討芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。方法經(jīng)免疫磁珠細(xì)胞分選法獲得小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞，設(shè)空白對照組、單加藥組和照射劑量1 Gy、4 Gy的照射加藥組。后2組均加入終濃度為10－8～10－3mol／L的芝麻酚，照射加藥組在照射前30min加藥，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)18 h。采用生物發(fā)光法檢測小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞的細(xì)胞活力，甲基纖維素半固體培養(yǎng)法檢測克隆形成能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果與對照組比較，1 Gy和4 Gy射線照射后小鼠c-kit陽性細(xì)胞的細(xì)胞活力分別下降59.52%和79.35%（P＜0.05），集落形成數(shù)量分別下降40.38%和87.69%（P＜0.05）；在10－8～10－6mol／L濃度范圍內(nèi)，芝麻酚可顯著提高小鼠c-kit陽性細(xì)胞細(xì)胞活力和集落形成數(shù)量，但對細(xì)胞凋亡無影響。結(jié)論芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用可能是通過提高造血祖細(xì)胞的增殖能力。

芝麻酚；c-kit陽性細(xì)胞；骨髓；輻射損傷；輻射防護(hù)；

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL／6小鼠50只，雄性，SPF級，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號：SCXK（京）2009-0017，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級條件飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器：芝麻酚購自美國 Sigma公司；Celltiter-GloTM細(xì)胞活力檢測試劑盒購自美國Promega公司；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基M3534購自加拿大Stem Cell Technologies公司；StemSpan Serum-Free Expansion Medium（SFEM）購自加拿大Stem Cell Technologies公司；FITC Annexin V／PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CD117 Microbeads購自德國MiltenyBiotec公司。137Csγ-射線照射源，劑量率為 1.01 Gy／min（Autocell40，加拿大原子能有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200，瑞士）；流式細(xì)胞儀（美國BD Accuri C6）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞培養(yǎng)：富集小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5min，無菌條件下取股、脛骨，用含2%胎牛血清的PBS沖洗骨髓細(xì)胞，用尼龍膜過濾后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；1500 r／min離心5 min，棄去上清后按照每109個(gè)細(xì)胞用200μL PBS懸起；按照每108個(gè)細(xì)胞加入20μL的CD117磁珠，冰上孵育15min；向細(xì)胞懸液中加入5 mL PBS，1 500 r／min離心 5min，洗滌1次；按照109細(xì)胞1mLPBS懸起細(xì)胞；LS柱子安裝到磁架上，加入3mL PBS，重力作用自然流盡潤柱。加入小鼠細(xì)胞懸液，過柱子后用3mL的PBS洗滌3次；將柱子從分離器上拿下，放到無菌管中，加入2mL PBS迅速吹打下所要細(xì)胞，再用1mL PBS吹打1次，離心、重懸、計(jì)數(shù)。

1.2.2 芝麻酚和輻射處理細(xì)胞：用無水乙醇溶解芝麻酚，使用帶有0.22μm濾膜的濾器過濾除菌。用SFEM培養(yǎng)基依次10倍稀釋芝麻酚溶液，分別稀釋成2×10－3、2×10－4、2×10－5、2×10－6、2×10－7、2×10－8mol／L。將細(xì)胞懸液調(diào)整到 1×106／mL的濃度，細(xì)胞懸液以每管1.8mL的量分配至8支5mL EP管當(dāng)中，然后加入含有不同劑量藥物的SFEM培養(yǎng)基1.8mL使芝麻酚終濃度分別為 10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8mol／L，細(xì)胞終濃度為5×105個(gè)／mL。將細(xì)胞懸液接種至96孔板，每孔180μL，每組6個(gè)平行孔。37℃孵育30min后將種好的96孔板接受不同劑量137Csγ-射線（0Gy、1 Gy、4Gy）照射。

1.2.3 小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞細(xì)胞活力的測定：用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行細(xì)胞活力測定［11］。細(xì)胞在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，將96孔板室溫放置30min，加入生物發(fā)光試劑Celltiter-GloTM20μL，振蕩2min后，轉(zhuǎn)入白色測定板室溫避光放置10min，用多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光信號，以相對熒光強(qiáng)度（relative light units，RLU）作為細(xì)胞活力單位。

1.2.4 小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞凋亡水平檢測：根據(jù)1.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇芝麻酚終濃度為 10－6、10－7、10－8mol／L的細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為5×105個(gè)／mL，將細(xì)胞懸液種6孔板，每孔2mL，每組3個(gè)平行孔，加藥后在37℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min進(jìn)行137Csγ-射線（0 Gy、1 Gy、4 Gy）照射細(xì)胞，之后 37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，吹打收集懸浮細(xì)胞至2 mL EP管內(nèi)，洗滌細(xì)胞，加入300μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞；再加入5μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min；上機(jī)前5 min加5μL PI染色，流式檢測?？瞻讓φ战M同時(shí)設(shè)置陰性對照、Annexin V、PI單染組。

1.2.5 小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞克隆形成能力檢測：用SFEM培養(yǎng)基調(diào)整c-kit＋細(xì)胞濃度為1×104個(gè)／mL（對照組）、2×104個(gè)／mL（1 Gy照射組）和 1×105個(gè)／mL（4 Gy照射組）［12-13］，加0.2mL稀釋好的細(xì)胞懸液至2mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，充分混勻后加入24孔板，每孔0.5mL，每組6個(gè)平行孔。輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入濕盒，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)第7天在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)≥50為陽性集落。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量資料用±s”表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞細(xì)胞活力的影響芝麻酚在濃度 10－8、10－7、10－6、10－5mol／L時(shí)能夠促進(jìn) c-kit＋細(xì)胞增殖，細(xì)胞活力分別為空白對照組（芝麻酚濃度0mol／L，細(xì)胞活力100%）細(xì)胞活力的109.8%、109.8%、107.8%和104.1%；但在10－4mol／L和 10－3mol／L時(shí)能明顯抑制 c-kit＋細(xì)胞增殖（P＜0.05，見圖1）。

圖1 不同濃度芝麻酚對骨髓c-kit＋細(xì)胞活力的影響*P＜0.05，與空白對照組相比Fig.1 Effects of different concentrations of sesamol on the viability of bonemarrow c-kit＋cells*P＜0.05，compared with blank control group

2.2 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用 與對照組比較，照射1Gy或4 Gy后骨髓細(xì)胞活力分別下降59.52%和79.35%，提示照射會(huì)導(dǎo)致造血系統(tǒng)骨髓c-kit＋細(xì)胞功能活力下降。與對照組比較，芝麻酚對照射后骨髓c-kit＋細(xì)胞活力有一定的保護(hù)作用：有效保護(hù)濃度在10－8～10－6mol／L，是細(xì)胞毒性劑量10－3的1／1 000～1／10 000（見表1）。

表1 不同濃度芝麻酚及1 Gy、4 Gy照射對骨髓c-kit＋細(xì)胞活力的影響Tab.1 Effects of different concentrations of sesamol and 1 Gy，4 Gy irradiation on the viability of bonemarrow c-kit＋cells

2.3 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響輻射損傷保護(hù)作用結(jié)果顯示 10－8、10－7、10－6mol／L濃度芝麻酚能夠保護(hù)小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞輻射損傷，因此以下實(shí)驗(yàn)芝麻酚濃度均選用10－8、10－7、10－6mol／L。與對照組比較，1 Gy、4 Gy照射后18 h，小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞早期和晚期凋亡率均顯著增加（P＜0.05），芝麻酚藥物組對骨髓c-kit陽性細(xì)胞細(xì)胞凋亡率沒有明顯作用（見圖2、表2）。

圖2 流式檢測小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞細(xì)胞凋亡Fig.2 Representative image ofmice bonemarrow c-kit positive cells apoptosis by flow cytometry

表2 不同濃度芝麻酚對1 Gy、4 Gy照射骨髓c-kit＋細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effects of different concentrations of sesamol and 1 Gy，4 Gy irradiation on apoptosis of bonemarrow c-kit＋cells

2.4 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞粒單系克隆形成能力的影響 1 Gy劑量照射組的集落形成數(shù)量較對照組下降40.38%（P＜0.05），4 Gy劑量照射組的集落形成數(shù)量較對照組下降87.69%（P＜0.05），表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的輻射損傷模型是成功的。在1 Gy照射時(shí)，10－7mol／L芝麻酚組較照射組集落形成數(shù)量提高了29.03%（P＜0.05）；在4Gy照射時(shí)，10－7和10－6mol／L芝麻酚組較照射組集落形成數(shù)量分別提高了56.25%和40.00%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖 3）。

圖3 芝麻酚及照射對小鼠粒單系克隆形成能力的比較*P＜0.05，與空白對照組相比Fig.3 Comparison of the effects of sesamol and irradiation on mice CFU-GM*P＜0.05，compared with blank control group

3 討論

造血干細(xì)胞是存在于造血組織中的一群特殊細(xì)胞，具有自我更新以及分化生成造血系統(tǒng)中各類成熟血細(xì)胞的原始細(xì)胞的能力。自我更新能力的差異導(dǎo)致了造血干細(xì)胞（haematopoietic stem cells，HSCs）功能的異質(zhì)性，進(jìn)而被分成3個(gè)不同亞群：長期造血干細(xì)胞（long term haematopoietic stem cells，LT-HSCs）、短期造血干細(xì)胞（short term haematopoietic stem cells，ST-HSCs）和多能祖細(xì)胞（multipotential predecessors，MPPs）［14］。造血系統(tǒng)是輻射損傷敏感靶器官，中低劑量射線照射易引起造血祖細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致急性骨髓抑制［15-16］。因此，造血系統(tǒng)中造血祖細(xì)胞對輻射較為敏感，有效的低毒性藥物能夠減輕輻射引起的造血祖細(xì)胞損傷。本研究旨在觀察芝麻酚對骨髓c-kit陽性細(xì)胞輻射損傷的體外保護(hù)作用，在正常骨髓中，約50%CD34＋祖細(xì)胞（包括定向的紅系、粒單系和巨核細(xì)胞系）表達(dá)c-kit（CD117）。c-kit表達(dá)被認(rèn)為是骨髓造血干細(xì)胞較早分化階段的特征性標(biāo)志［17］。故實(shí)驗(yàn)選取骨髓c-kit＋細(xì)胞作為研究對象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：芝麻酚對 c-kit＋細(xì)胞毒性作用較小，在濃度為10－8～10－5mol／L時(shí)細(xì)胞活力水平變化不大，僅在濃度＞10－4mol／L時(shí)候有明顯的細(xì)胞毒性作用。

1Gy、4 Gy劑量照射前加入芝麻酚孵育30min，與未加芝麻酚組比較，細(xì)胞活力明顯增加，說明芝麻酚對小鼠骨髓c-kit＋細(xì)胞輻射損傷有一定保護(hù)作用。觀察到這一作用后，本研究繼續(xù)探討保護(hù)作用的可能機(jī)制。集落形成實(shí)驗(yàn)是功能實(shí)驗(yàn)，檢測骨髓造血祖細(xì)胞增殖能力，c-kit＋細(xì)胞集落形成能力的結(jié)果顯示，使用芝麻酚后c-kit＋細(xì)胞集落形成能力顯著增加，說明芝麻酚能夠有效提高造血祖細(xì)胞的增值能力，與本實(shí)驗(yàn)室之前體內(nèi)研究結(jié)果一致［10］。射線照射會(huì)引起c-kit＋細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，但芝麻酚對細(xì)胞凋亡未見明顯的改善作用。

芝麻酚對小鼠骨髓c-kit＋細(xì)胞輻射損傷有一定的保護(hù)作用，其最直接的作用是提高骨髓c-kit＋細(xì)胞粒單系克隆形成能力。盡管芝麻酚對射線引起的細(xì)胞直接損傷沒有明顯的保護(hù)作用，但能夠減輕射線對祖細(xì)胞增殖的抑制作用，更深層次的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

［1］ Wang Y，Liu L，Pazhanisamy SK，et al.Total body irradiation causes residual bonemarrow injury by induction of persistent oxidative stress in murine hematopoietic stem cells［J］.Free Radic Biol Med，2010，48（2）：348-356.

［2］ Wang Y，Schulte BA，LaRue AC，etal.Total body irradiation selectively inducesmurine hematopoietic stem cell senescence［J］.Blood，2006，107（1）：358-366.

［3］ Shao L，F(xiàn)eng W，Li H，et al.Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a-and Arf-independent manner［J］.Blood，2014，123（20）：3105-3115.

［4］ Meng A，Wang Y，Van Zant G，et al.Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells［J］.Cancer Res，2003，63（17）：5414-5419.

［5］ 鄒仲敏，孫慧勤，羅成基.6 Gyγ射線誘導(dǎo)骨髓造血細(xì)胞凋亡［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1998，18（6）：390-392.

［6］ Okada S，Nakauchi H，Nagayoshi K，etal.In vivo and in vitro stem cell function of c-kit-and Sca-1-positive murine hematopoietic cells［J］.Blood，1992，80（12）：3044-3450.

［7］ Kanimozhi P，Prasad NR.Antioxidant potential of sesamol and its role on radiation-induced DNA damage in whole-body irradiated Swiss albinomice［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2009，28（2）：192-197.

［8］ Jnaneshwari S，Hemshekhar M，Thushara RM，et al.Sesamol ameliorates cyclophosphamide-induced hepatotoxicity by modulating oxidative stress and inflammatorymediators［J］.Anticancer AgentsMed Chem，2013 Dec 24.［Epub ahead of print］

［9］ 鄔志薇，蔣霞，童星，等.芝麻酚清除自由基及對輻照大鼠抗氧化能力的影響［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2013，33（1）：37-39.

［10］ 路璐，李德冠，張俊伶，等.芝麻酚對4Gy137Csγ射線照射小鼠造血功能的影響［J］.中國生化藥物雜志，2014，34（1）：26-28.

［11］ Noah JW，SeversonW，Noah DL，etal.A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals［J］.Antiviral Res，2007，73（1）：50-59.

［12］ Zhang H，Wang YA，Meng A，et al.Inhibiting TGFβ1 has protective effect on mouse bone marrow suppression following ionizing radiation exposure in vitro［J］.JRadiat Res，2013，54（4）：630-636.

［13］ 張俊伶，路璐，李德冠，等.N-乙酰半胱氨酸對輻射致小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（1）：54-57.

［14］ Shao L，Luo Y，Zhou D.Hematopoietic stem cell injury induced by ionizing radiation［J］.Antioxid Redox Signal，2014，20（9）：1447-1462.

［15］ Greenberger JS，Epperly M.Bone marrow-derived stem cells and radiation response［J］.Semin Radiat Oncol，2009，19（2）：133-139.

［16］ 王月英，吳紅英，李德冠，等.不同劑量137Csγ射線照射對小鼠造血系統(tǒng)的影響［J］.國際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志，2013，37（1）：1-4.

［17］ Ikuta K，Eissman IL.Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（4）：1502-1506.

（編校：吳茜）

Protective effects of sesamol on radiation injury mouse bonemarrow c-kit＋cell

LU Lu，ZHANG Jun-ling，LIDe-guan，MENG Ai-min

（Institute of Radiation Medicine，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical Collage.
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine，Tianjin 300192，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of sesamol on radiation injury mouse bone marrow c-kit＋cell，and further explore its possiblemechanism.MethodsMouse bonemarrow c-kit＋cellswere collected by immunomagnetic cellsortingmethod.Therewere2 groups in the study：single dosing group and radiation plus drug group（doses of irradiation included 1Gy and 4Gy），and 10－8～10－3mol／L sesamolwere co-cultured with mouse bonemarrow c-kit＋cell half hour before irradiation exposure，cells were then cultured for 18 hours under the conventional culture conditions（37℃ and 5%CO2）.The viability ofmouse bone marrow c-kit＋cells were measured by bioluminescence.The ability of colony-forming units were detected by CFU-GM and apoptotic rate of c-kit＋cellswere detected by Annexin V／PIantiapoptotic assay.ResultsCompared with control group，after 1Gy and 4Gy irradiated，cell viability ofmouse bonemarrow c-kit＋cellswere decreased 59.52%and 79.35%，respectively（P＜0.05），the number of colony-forming were decreased 40.38%and 87.69%，respectively（P＜0.05）.Cell viability of c-kit＋cells and the number of colonies formed were significantly increased with sesamol concentration between 10－8～10－6mol／L，butnot improve apoptosis rate.ConclusionSesamol has protective effect on irradiation-induced injury in mouse bonemarrow c-kit＋cells，themechanism ofwhichmay be related to the ability of hematopoietic progenitor cells proliferation.

sesamol；c-kit＋cell；bonemarrow；radiation injury；radiation protection

R551

A

1005－1678（2014）04－0001－04

造血細(xì)胞是一個(gè)增殖活躍的細(xì)胞群，當(dāng)受到放射線損傷時(shí)，即會(huì)發(fā)生造血功能障礙，其主要原因之一是殺傷了維持造血功能的造血干／祖細(xì)胞［1-4］，機(jī)體造血主要依靠造血祖細(xì)胞來擴(kuò)增［5］。c-kit是造血祖細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞因子的受體［6］。

芝麻酚（sesamol，SM）化學(xué)名稱為 3，4-亞甲二氧基苯酚，原由芝麻油提取分離而得，具有一定的損傷防護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，芝麻酚可有效降低受照小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷［7］，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝毒性［8］，提高60Coγ射線照射大鼠的抗氧化能力［9］，本實(shí)驗(yàn)室先前研究結(jié)果顯示芝麻酚可以提高小鼠骨髓細(xì)胞粒單系克隆形成能力［10］。但芝麻酚在體外對造血細(xì)胞是否也有保護(hù)作用并不清楚。本文旨在探討芝麻酚對小鼠骨髓c-kit＋細(xì)胞輻射損傷后的影響。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81372928）；協(xié)和青年基金和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（3332013044）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所學(xué)科發(fā)展專項(xiàng)基金（1340）

路璐，女，碩士，助理研究員，研究方向：造血和免疫輻射損傷防治，E-mail：lulu＠irm-cams.ac.cn。