趙欣

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸科，河南 新鄉(xiāng)453000）

載micro RNA-34a脂質(zhì)體靶向治療肺癌干細(xì)胞靶的研究

趙欣

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸科，河南 新鄉(xiāng)453000）

目的制備載microRNA-34 a脂質(zhì)體（miLPs-34 a），研究其肺癌干細(xì)胞靶向性以及對肺癌干細(xì)胞的生長抑制能力。方法采用薄膜分散法制備載microRNA-34 a脂質(zhì)體，考察脂質(zhì)體的粒徑，電位以及包封率;考察載microRNA-34 a脂質(zhì)體的血清穩(wěn)定性。通過細(xì)胞攝取實驗考察肺癌干細(xì)胞對miLPs-34 a的攝取效率。MTT實驗考察microRNA-34 a對肺癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性;構(gòu)建肺癌干細(xì)胞腫瘤球模型，考察脂質(zhì)體對腫瘤球的生長抑制能力。構(gòu)建肺癌裸鼠異位模型，考察脂質(zhì)體對腫瘤生長抑制效果。結(jié)果miLPs-34 a的粒徑在136.55±11.4 nm，電位為21.45±4.55 mV，microRNA-34 a的包封率為94.6%。miLPs-34 a在24 h內(nèi)，50%的血清中具有良好的血清穩(wěn)定性。細(xì)胞攝取實驗結(jié)果顯示，A 549肺癌干細(xì)胞對miLPs-34 a的攝取效率是microRNA-34 a的3.1倍(P＜0.01);MTT實驗表明miLPs-34 a對肺癌干細(xì)胞的毒性顯著強于microRNA-34 a(P＜0.01);腫瘤球抑制實驗結(jié)果表明miLPs-34 a對腫瘤球的生長抑制能力顯著強于microRNA-34 a，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），miLPs-34 a具有良好的抗肺癌作用。荷瘤裸鼠腫瘤生長抑制實驗結(jié)果表明miLPs-34 a對裸鼠腫瘤生長的抑制能力顯著強于microRNA-34 a，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論載microRNA-34 a脂質(zhì)體具有良好的肺癌干細(xì)胞靶向性和抗肺癌干細(xì)胞生長作用，是一種潛在高效的肺癌干細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。

腫瘤干細(xì)胞;microRNA-34 a;脂質(zhì)體;肺癌

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Sizer Nano ZS 90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國Malvern instruments Ltd）；Bio-Tek ELX 800光吸收酶標(biāo)儀（美國寶特儀器公司）；大豆磷脂（SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司）；DOTAP（美國Avanti polar lipids）；DSPE-PEG 2000（美國Avanti polar lipids）；異硫氰黃熒光素標(biāo)記的磷脂（FITC-PE，美國sigma）；microRNA-34 a（上海吉瑪生物技術(shù)有限公司）；Cy3標(biāo)記的microRNA-34 a（美國GIBCO公司）；DSPE-PEG 2000-MAL (美國sigma)；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；其余試劑為分析純。人源肺癌細(xì)胞（A549，ATCC)；昆明小鼠與裸鼠（許可證號：20135486154；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心）。

1.2 方法

1.2.1 載microRNA-34 a脂質(zhì)體的制備及表征 精密稱取大豆磷脂4 mg，膽固醇2 mg，DSPE-PEG 20001 mg，DOTAP 2 mg，將以上材料和藥物溶于氯仿中，在茄形瓶中減壓蒸餾成膜，除去有機溶劑，置于真空干燥器中過夜，使其充分干燥，加入1 ml PBS水化，探頭超聲（80 W，10 s，10 s，5次）得到空白脂質(zhì)體。取一定量上述空白脂質(zhì)體溶液稀釋至50μL，逐滴加入等體積的RNA（miRNA）溶液，在室溫下輕輕振搖孵育30 min，即得miLPs-34 a溶液。采用相同方法制備miLPs-34 a（Cy3）。

取適量制備得到的脂質(zhì)體樣品0.1 mL稀釋到1 mL，用激光粒度儀測定其粒徑和電位。采用超濾離心法測定miRNA的包封率。取100μL所制備的miLPs-34 a（Cy3），用超濾管（300 kD），轉(zhuǎn)速3500離心30 min。收集超濾管收集管中的澄清液體，并稀釋至合適濃度，用酶標(biāo)儀在Ex=555 nm，Em=570 nm處測定其熒光強度。按照EE%=W包/W投×100%計算包封率。

1.2.2 載microRNA-34 a脂質(zhì)體的血清穩(wěn)定性考察 取脂質(zhì)體樣品500μL，每個樣品3份。分別與等體積的磷酸鹽緩沖液、含有50%胎牛血清（FBS）的磷酸鹽緩沖液混合，于37℃下孵育1、4、8、12、24 h，分別測定其在750 nm的透光率[7-8]。以樣品在磷酸鹽緩沖液中的透光率值為空白，以樣品在含有50% FBS的磷酸鹽緩沖液中的透光率與其在磷酸鹽緩沖液中的透光率的比值來評價納米粒在血清中的穩(wěn)定性。

1.2.3 肺癌干細(xì)胞對miLPs-34 a的攝取考察 將A549肺癌干細(xì)胞按照1×105細(xì)胞/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，在孔板中加入Cy3標(biāo)記的microRNA-34 a和miLPs-34 a（Cy3），每組設(shè)3組重復(fù)，每個孔加入100 uL，每一個細(xì)胞孔給藥量相當(dāng)于0.7μg miRNA。于CO2培養(yǎng)箱中分別孵育2 h和4 h，棄去培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗3次，加入1 mL 1% Triton-100裂解細(xì)胞，4℃避光裂解30 min以上，待裂解完全后，取各組樣品各200 uL在Ex=555 nm，Em=570 nm用熒光分光光度計測定的熒光強度。

1.2.4 MTT方法考察miLPs-34 a對肺癌干細(xì)胞的增殖抑制作用 培養(yǎng)A 549腫瘤干細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入無菌過濾后的空白脂質(zhì)體、microRNA-34 a和miLPs-34 a。每組設(shè)6組重復(fù)，每孔加入相當(dāng)于miRNA的量為150 nM的脂質(zhì)體（或空白脂質(zhì)體）。將孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后取出，每孔加入20μL 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200μl DMSO，37℃避光振搖15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的光密度值。

1.2.5 肺癌腫瘤球的構(gòu)建及miLPs-34 a對腫瘤球的抑制作用 取對數(shù)生長期的A549腫瘤干細(xì)胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，并將細(xì)胞吹打下來后離心，棄去上清液用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于用低熔點瓊脂糖預(yù)處理的96孔板中，將96孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)。7天后成長為腫瘤球，腫瘤球體積約為0.5 mm3，以帶標(biāo)尺的目鏡觀察腫瘤球的半徑，按球體積計算公式V=（4/3）πR3計算腫瘤球的體積。為了考察miLPs-34 a對腫瘤球生長的抑制效果，腫瘤球生長7天后，加入空白脂質(zhì)體、microRNA-34 a和miLPs-34 a。每組設(shè)3組重復(fù)，每孔加入相當(dāng)于miRNA的量為150 nM的脂質(zhì)體（或空白脂質(zhì)體）。以PBS為陰性對照組，統(tǒng)計腫瘤球體積大小變化情況。

1.2.6 肺癌異位腫瘤模型的構(gòu)建及miLPs-34 a對腫瘤的抑制作用 A549腫瘤干細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個/mL。取4～6周齡，體重20～25 g的雄裸鼠，將準(zhǔn)備好的A549腫瘤干細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 ml細(xì)胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。

待腫瘤直徑達(dá)到約10 mm左右時優(yōu)選15只荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組5只，分別為microRNA-34 a組、miLPs-34 a組和PBS組，給藥量以miRNA量計10μg/20 g。荷瘤裸鼠每天觀察其活動度和飲食習(xí)慣，每2天給藥一次并用游標(biāo)卡尺測量其腫瘤大?。╩m3），腫瘤體積按照公式V=長×寬2×0.52計算[9]，計算各天相對于初始0天的腫瘤體積比： 腫瘤體積變化率（%）=腫瘤體積 /（腫瘤初始體積）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料多組間比較用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 microRNA-34 a脂質(zhì)體的粒徑、電位以及包封率 制備得到的miLPs-34 a的粒徑為（136.55±11.4）nm，電位為（21.45±4.55）mV，microRNA-34 a的包封率為94.6%。

2.2 microRNA-34 a脂質(zhì)體具有良好的血清穩(wěn)定性 血清穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，miLPs-34 a在50%的血清中的透光率與其在PBS中的透光率的比值均接近100%，表明脂質(zhì)體24 h在血清中具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 A549肺癌干細(xì)胞對microRNA-34 a脂質(zhì)體攝取 細(xì)胞攝取實驗結(jié)果見圖1。腫瘤干細(xì)胞對miLPs-34 a的攝取量隨著時間的延長而增加，miLPs-34 a在4 h攝取效率（31.5%±2.3%）是2 h（18.1%±2.8%）的1.74倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.36，P=0.034）；腦腫瘤干細(xì)胞對miLPs-34 a的攝取效率4 h（31.5%±2.3%）約是游離microRNA-34 a 4 h（10.2%±1.0%）的3.1倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.22，P=0.003）。

圖1 肺癌干細(xì)胞對miLPs-34 a和microRNA-34 a的攝取效率比較。**P＜0.01，與4 h時 microRNA的攝取相比；△P＜0.05，與2 h時miLPs-34 a的攝取相比Fig.1 The cellular uptake of miLPs-34 a and microRNA-34 a in vitro at 2 h and 4 h incubation**P＜0.01，compared with the microRNA uptake in 4 h；△P＜0.05，compared with the miLPs-34 a uptake in 2 h

2.4 microRNA-34 a脂質(zhì)體抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖和腫瘤球的生長 MTT實驗結(jié)果見圖2。miLPs-34 a和microRNA-34 a均能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且對腫瘤干細(xì)胞的增殖抑制率隨著時間的延長而增長，miLPs-34 a在48 h對肺癌干細(xì)胞的抑制率（69.0%±12.3%）是24 h（45.1%±10.7%）的1.53倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.36，P=0.024）；在給藥48 h后，miLPs-34 a對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率（69.0%±12.3%）是microRNA-34 a（29.1%）的2.37倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.34，P=0.000）?？瞻字|(zhì)體對腫瘤干細(xì)胞也有一定的毒性。miLPs-34 a對腫瘤球的抑制實驗結(jié)果顯示，給藥7天后，PBS組腫瘤球持續(xù)生長，體積增大1.45倍，microRNA-34 a組腫瘤球體積增大到原體積的1.32倍，miLPs-34 a組腫瘤球體積減小到原體積的77%。與PBS組相比，microRNA-34 a和miLPs-34 a能抑制腫瘤球的生長，這說明microRNA-34 a對肺癌干細(xì)胞增殖具有良好的抑制效果，脂質(zhì)體包載能夠保護(hù)microRNA-34 a，增強對肺癌干細(xì)胞的抑制作用。miLPs-34 a對腫瘤球的生長抑制能力顯著強于microRNA-34 a，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007）。各組不同天數(shù)間重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示， PBS、microRNA-34 a、miLPs-34 a各時間段間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.32、10.58、10.55，P=0.031、0.039、0.030，見表1）。

圖2 肺腫瘤干細(xì)胞MTT實驗中的存活率**P＜0.01，與空白脂質(zhì)體和microRNA-34 a比較；△P＜0.05，與24 h時肺癌干細(xì)胞存活率比較Fig.2 The cell viability of lung cancer stem cells at various drugs after 24 h and 48 h treatments**P＜0.01，compared with blank liposome and microRNA-34 a；△P＜0.05，compared with The cell viability of lung cancer stem cells in 24 h

表1 給藥后腫瘤球體積變化Tab.1 The change ratio of tumor spheroid after 7 days

2.5 microRNA-34 a脂質(zhì)體抑制腫瘤球和荷瘤裸鼠腫瘤的生長 腫瘤直徑達(dá)到約10 mm左右時用于后續(xù)實驗。miLPs-34 a對荷瘤裸鼠每3天給藥一次，記錄裸鼠腫瘤體積的大小，與初始腫瘤體積的比值計算相對腫瘤大小。荷瘤裸鼠的治療實驗結(jié)果顯示，給藥后第21天，PBS組腫瘤體積增長為原體積的2.15倍，microRNA-34 a腫瘤體積增長為原腫瘤體積的1.85倍，而miLPs-34 a組腫瘤體積只增長為原體積1.52倍，這說明miLPs-34 a對裸鼠腫瘤生長的抑制能力顯著強于microRNA-34 a，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021）。各組不同天數(shù)間重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，PBS、microRNA-34 a、miLPs-34 a各時間段間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.56、17.64、18.04，P=0.025、0.028、0.027，見表2）。

表2 各給藥組對荷瘤裸鼠腫瘤生長的抑制效果Tab.2 The tumor volume of initial after treatment with different drugs

3 討論

有觀點認(rèn)為，腫瘤治療失敗或者腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因是腫瘤干細(xì)胞具有耐藥和耐輻射的特性，且腫瘤干細(xì)胞長期處于休眠狀態(tài)[10]。因此殺傷腫瘤干細(xì)胞成為了腫瘤治療的一種新途徑。腫瘤干細(xì)胞具有強大的自我更新能力、分化能力和致瘤能力等特點[2-3]。因此，對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向給藥成為了一種理想的腫瘤治療方法。在包括肺癌的多種癌癥中CD44已經(jīng)被證明可以作為一種腫瘤干細(xì)胞亞群的重要標(biāo)記分子[11]。王教等[12]將microRNA-34 a包載于商品化脂質(zhì)體lipofectamine中能夠有效抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖。最近研究強調(diào)miR-34 a能夠通過直接抑制腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物CD 44的活性，從而作為抑制腫瘤干細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)劑[13]，Sanjun Shi等[14]采用固體脂質(zhì)納米粒包載miR-34a后實現(xiàn)了對小鼠黑色素瘤的靶向抑制。這就說明CD 44是miR-34a的直接作用的靶標(biāo)。由于在抑制腫瘤干細(xì)胞分化中的重要作用，miR-34 a在肺癌治療中具有廣闊的前景[15]。本研究以CD44為標(biāo)記物的肺癌干細(xì)胞為靶標(biāo)，考察miLPs-34a抗腫瘤干細(xì)胞的作用。

本研究采用薄膜分散法制備了空白陽離子脂質(zhì)體，利用miRNA與陽離子脂質(zhì)體的靜電吸附作用孵育得到載microRNA-34a的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的粒徑在135 nm左右，包封率大于90%。肺癌干細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取效率是游離miRNA的3.1倍，這可能是由于以下兩方面原因：（1）由于陽離子脂質(zhì)體所帶的正電荷能夠介導(dǎo)脂質(zhì)體入胞，增強了入胞效率；（2）脂質(zhì)體與細(xì)胞膜通過膜融合作用介導(dǎo)脂質(zhì)體入胞。肺癌干細(xì)胞的增殖抑制實驗結(jié)果表明，空白陽離子脂質(zhì)體由于具有較強正電荷，對腫瘤干細(xì)胞有一定的毒性。裸鼠肺癌腫瘤抑制實驗結(jié)果表明，經(jīng)過脂質(zhì)體包載后，microRNA-34a對腫瘤的抑制作用得到了增強。這是由于脂質(zhì)體包載后能夠保護(hù)miRNA在血液循環(huán)過程中不被核酸酶破壞。綜上所述，本研究構(gòu)建了載microRNA-34a的脂質(zhì)體，通過體外腫瘤干細(xì)胞增殖抑制實驗、腫瘤球生長抑制試驗和體內(nèi)腫瘤生長抑制實驗證實miLPs-34a能夠有效的靶向抑制肺癌干細(xì)胞和肺腫瘤，miLPs-34a是一種潛在的有效的肺癌干細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。

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The study of microRNA-34 a loaded liposome inhibit lung cancer stem cells

ZHAO Xin
（Department of Respiration, The First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University， Xinxiang 453000, China）

ObjectiveTo preparemicroRNA-34 a loaded liposome and evaluate the targeting ef fi ciency for lung cancer stem cells and effect on the treatment of lung cancer。MethodThe liposomes were prepared by thin fi lm hydration method. The particle size，Zeta potential and entrapment ef fi ciency were evaluated. Stability of liposome in serum was evaluated. The ef fi ciency of cellular uptake on lung cancer stem cells in vitro was evaluated. The antiproliferation ef fi ciency of miLPs-34 a was evaluated by MTT assay. Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of miLPs-34 a. Lung cancer stem cells were used to build orthotopictumor model, which were used to evaluate the effect of anti-cancer。ResultsThe particle diameter of the miLPs-34 a was (136.55±11.4) nm with the Zeta potential of (21.45±4.55) mV. The entrapment ef fi ciency of microRNA-34 awas 94.6%.the results demonstrated that the liposomes could keep stable in 50% serum for 24 h. miLPs-34 a uptaken by lung cancer stem cells were 3.1 times higher than that of microRNA-34 a(P＜0.01). The MTT assay con fi rmed strong inhibitory effect of miLPs-34 a than microRNA-34 a(P＜0.01). the inhibition of tumor spheroid con fi rmed strong inhibitory effect of miLPs-34 a than microRNA-34 a(P＜0.01). The anti-tumor of miLPs-34 a was much more effectively than microRNA-34 a(P＜0.01).Conclusion the microRNA-34 a loaded liposome could target to lung cancer stem cells and inhibit the proliferation of lung cancer stem cell. MiLPs-34 a, as a new nanometer drug, has a special application value for the therapy of lung cancer stem cell.

tumor stem cell；microRNA-34 a；liposome；lung cancer

R 734.2;R 730.5

A

1005-1678(2014)01-0068-04

肺癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的頭號惡性腫瘤，國內(nèi)每年新發(fā)肺癌約50萬，到2025年預(yù)計我國每年將有100萬肺癌患者。擺在臨床醫(yī)師特別是腫瘤治療醫(yī)師面前的任務(wù)是極其繁重和艱巨的[1]。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究發(fā)展，越來越多的研究表明在腫瘤組織中存在著數(shù)量稀少的一類癌細(xì)胞，在腫瘤形成過程中充當(dāng)干細(xì)胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潛能，雖然數(shù)量少，卻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，由于其眾多性質(zhì)與干細(xì)胞相似，所以這些細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells，CSCs）[2-3]?，F(xiàn)已經(jīng)證明了多種腫瘤具有腫瘤干細(xì)胞，包括腦膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸瘤、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌[4]以及肺癌[5]等。

MicroRNA-34 a（miR-34 a）是與人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的最突出的內(nèi)源性miRNA之一，它是一種腫瘤抑制基因，能夠有效的抑制腫瘤的發(fā)展[6]。然而， miRNA是一種不穩(wěn)定的親水分子，容易受到核酸酶的攻擊而失活，因此其治療效果會受到影響。脂質(zhì)體是一種將藥物包封于類脂雙分子層形成的脂膜中所制成的超微球狀載體制劑，能夠?qū)iRNA包載于脂質(zhì)體內(nèi)部，一方面使miRNA能夠靶向到達(dá)腫瘤組織，另一方面也能夠有效保護(hù)miRNA免受體內(nèi)核酸酶的破壞。本研究構(gòu)建了載microRNA-34 a脂質(zhì)體（miLPs-34 a），研究其對肺癌干細(xì)胞的靶向性以及對肺癌干細(xì)胞的生長抑制作用。

趙欣，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病以及肺部腫瘤，E-mail：529827419@qq.com。