宋航，臧傳寶，劉小盾，侯懷水，李棟,2△

(1.山東省齊魯干細(xì)胞工程有限公司，山東 濟(jì)南 250000；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 低溫醫(yī)學(xué)研究室，山東 濟(jì)南 250012)

胎盤凍干粉對小鼠延緩衰老作用的研究

宋航1，臧傳寶1，劉小盾1，侯懷水1，李棟1,2△

(1.山東省齊魯干細(xì)胞工程有限公司，山東 濟(jì)南 250000；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 低溫醫(yī)學(xué)研究室，山東 濟(jì)南 250012)

目的研究胎盤凍干粉對小鼠延緩衰老的作用。方法將2月齡雌性小鼠隨機(jī)分為5組：空白組、衰老組、陽性組、胎盤粉低劑量組和高劑量組。除空白組外，其余各組均采用皮下注射相同劑量D-半乳糖42 d建立小鼠衰老模型，同時各組分別灌胃相應(yīng)的藥物，最后檢測小鼠機(jī)體內(nèi)免疫力及生理調(diào)控相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果胎盤粉2個劑量組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于衰老組（P＜0.05），大腦中的MDA含量顯著低于衰老組（P＜0.05），外周血中的CD4和CD8細(xì)胞比例、血清中雌性激素（P和E 2）、免疫球蛋白(IgG)以及造血因子（EPO、G-CSF和M-CSF）的含量均顯著高于衰老組（P＜0.05）。結(jié)論胎盤凍干粉能夠通過提高機(jī)體免疫力、改善生理調(diào)控來達(dá)到延緩衰老的作用。

胎盤凍干粉;D-半乳糖; 延緩衰老

胎盤是哺乳類胎生動物在懷胎時為胎兒供應(yīng)養(yǎng)分，讓胚胎生長的特殊組織。胎盤作為補(bǔ)藥在我國已有1000多年的歷史，在《本草綱目》中胎盤被稱為“紫河車”，具有“安心養(yǎng)血、益氣、補(bǔ)精、解毒、補(bǔ)血”的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：胎盤組織中所含有的雌性激素、細(xì)胞活性因子以及肽類物質(zhì)[1-3]能夠改善女性內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖、提高機(jī)體免疫力[4-5]等。

本實(shí)驗(yàn)主要研究小鼠在D-半乳糖誘導(dǎo)衰老過程中經(jīng)過喂食胎盤凍干粉后機(jī)體內(nèi)免疫力及生理調(diào)控相關(guān)指標(biāo)的變化，探究胎盤粉對小鼠延緩衰老作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 D-半乳糖（衰老模型造模試劑，體內(nèi)過量容易引起糖代謝紊亂造成自由基增加從而誘導(dǎo)衰老形成）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素E（陽性對照物，能夠促進(jìn)生殖和抗自由基氧化等）購自生工生物；紅細(xì)胞裂解液購自百浩生物科技有限公司；Anti-Mouse CD 4/CD 8 FITC/PE標(biāo)記抗體和Mouse IgG Isotype Control FITC/PE標(biāo)記抗體購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.1.2 試劑盒 MDA（丙二醛，TBA法）和蛋白定量（考馬斯亮藍(lán)法）試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，小鼠PRL（催乳素）、P（孕酮）、E2（雌二醇）、EPO（促紅細(xì)胞生成素）、G-CSF（粒細(xì)胞集落刺激因子）、M-CSF（巨噬細(xì)胞集落刺激因子）和IgG（免疫球蛋白）Elisa試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 高速組織研磨機(jī)（上海冰都電器有限公司，Q400 B3）；冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司，LGJ-10B）；電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，AL 204）；超聲波細(xì)胞破碎儀（SONICS，VCX-130）；低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-5C）；高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-18C-C）；紫外光度計（UNICO，UV-2800）；微毛細(xì)管流式細(xì)胞儀（Millipore，6HT）。

1.1.4 胎盤凍干粉制作過程 新鮮人胎盤取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院產(chǎn)科，均獲得產(chǎn)婦知情同意，本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。胎盤用生理鹽水沖洗并切成約2 cm×2 cm的小塊；將胎盤冷凍在－80℃下；將冷凍好的胎盤切塊放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥以去除多余水分，將干燥后的胎盤利用高速組織研磨機(jī)（29000 rpm條件下）研磨成粉末，整個過程在低溫進(jìn)行，較好地保存了胎盤內(nèi)的活性物質(zhì)。

1.2 動物分組及飼養(yǎng)方法 選取2月齡的昆明雌性小鼠50只，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，然后選取35只體重相近的隨機(jī)分為5組：空白組、衰老組、陽性組、胎盤粉低劑量組（粉低組）和胎盤粉高劑量組（粉高組）。

小鼠飼養(yǎng)環(huán)境及操作：每籠5只，環(huán)境溫度（27±1）℃，日光燈照明12 h交替，自由進(jìn)食。除空白組外，其余各組均采用皮下注射相同劑量D-半乳糖[0.4 g/(kg·d）]42 d建立小鼠衰老模型，同時各組分別灌胃各自相同體積的干預(yù)藥物：衰老組灌胃生理鹽水、陽性組灌胃維生素E水溶液[0.2 g/(kg·d）]、粉低組灌胃低劑量胎盤粉[0.4 g/(kg·d）]、粉高組灌胃高劑量胎盤粉[0.8 g/ (kg·d）]，每次灌胃體積為0.2 mL。飼養(yǎng)6周后，禁食過夜，第二天進(jìn)行眼球摘取取血，之后引頸處死。解剖小鼠取肝臟、脾臟、胸腺、卵巢以及大腦組織，然后置于－80℃下保存待測。小鼠血液取出后立刻在300 g條件下分離血漿和血細(xì)胞，血漿保存在－20℃下，分離的血細(xì)胞經(jīng)過紅細(xì)胞裂解液和生理鹽水清洗后獲得混合淋巴細(xì)胞，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4和CD8細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例。

1.3 測定指標(biāo) 小鼠胸腺系數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）；小鼠脾臟系數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）；小鼠卵巢指數(shù)=卵巢質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）；大腦和肝臟中丙二醛（MDA）的含量（TBA法）；血清中的激素：催乳素（PRL）、孕酮（P）和雌二醇（E2）的含量（酶聯(lián)免疫法）；血清中的造血因子：促紅細(xì)胞生成素（EPO）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的含量（酶聯(lián)免疫法）；血清中免疫球蛋白（IgG）含量（酶聯(lián)免疫法）；外周血中CD4和CD8淋巴細(xì)胞所占比例（流式細(xì)胞術(shù)）。

1.4 統(tǒng)計方法 對于正態(tài)計量數(shù)據(jù)以“x±s”表示，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時衰老組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和卵巢指數(shù)均顯著低于空白組小鼠（P＜0.05，見表1），證明衰老小鼠模型建立成功。粉低組和粉高組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于衰老組（P＜0.05），卵巢指數(shù)雖然低于空白組和陽性組，但均高于衰老組且粉低組，具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和卵巢指數(shù)(n=7)Tab.1 Thymus index, spleen index and overy index (n=7)

2.2 小鼠大腦和肝臟中MDA含量 粉低組和粉高組小鼠的大腦MDA含量均顯著低于衰老組（P＜0.05，見表2），肝臟MDA含量中粉高組顯著低于衰老組，粉低組雖低于衰老組但無顯著性差異。

表2 小鼠大腦和肝臟中MDA含量(n=7)Tab. 2 Contents of MDA in brain and liver (n=7)

2.3 小鼠血清中雌性激素的含量 粉低組和粉高組小鼠血清中雌二醇（E2）和孕酮（P）含量明顯高于衰老組（P＜0.05，見表3）。催乳素（RPL）含量也都高于衰老組，但沒有顯著性差異。

表3 小鼠血清中激素的含量(n=7)Tab.3 Contents of female hormone in serum (n=7)

2.4 小鼠血清中造血因子與免疫球蛋白的含量 粉低組和粉高組小鼠血清中促紅細(xì)胞生成素（EPO）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）以及免疫球蛋白（IgG）的含量均明顯高于衰老組（P＜0.05，見表4）。

表4 小鼠血清中造血因子與免疫球蛋白的含量(n=7)Tab.4 contents of haemopoietic factor and IgG (n=7)

2.5 小鼠外周血中CD4和CD8細(xì)胞所占比例 粉低組和粉高組小鼠外周血中CD4和CD8淋巴細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞中所占比例均明顯高于衰老組（P＜0.05，見表5）。

表5 小鼠外周血中CD4和CD8淋巴細(xì)胞所占比例(n=7)Tab.5 proportions of CD 4 and CD 8 lymphocyte in total lymphocyte (n=7)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的胎盤粉為凍干處理，其優(yōu)勢在于避免了高溫對于胎盤中活性物質(zhì)的破壞，最大限度地保證了胎盤中原有成分的活性。同時實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖注射法建立衰老小鼠模型，連續(xù)注射D-半乳糖會導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇堆積，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、影響機(jī)體代謝、自由基堆積從而導(dǎo)致機(jī)體衰老[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和卵巢指數(shù)均顯著低于空白組小鼠(P＜0.05)，而大腦和肝臟中MDA含量均高于空白組，證明衰老模型造模成功。本實(shí)驗(yàn)主要研究觀察機(jī)體內(nèi)免疫力及生理調(diào)控相關(guān)指標(biāo)的變化來分析胎盤凍干粉在延緩衰老方面的作用。

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，主要參與細(xì)胞免疫。脾臟中有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，與體液免疫關(guān)系更為密切。其重量與其功能以及其中免疫細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，其臟器指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)中粉低組和粉高組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于衰老組(P＜0.05)，說明胎盤粉對于維持主要免疫器官功能具有積極作用，有利于維持和提高機(jī)體免疫力。卵巢除具有生育功能外，其分泌的雌激素對女性的正常發(fā)育、疾病抵御具有重要作用，卵巢的衰老也是女性機(jī)體衰老的開始[7]。實(shí)驗(yàn)中粉低組和粉高組的卵巢指數(shù)雖然低于空白組和陽性組，但均高于衰老組，說明胎盤凍干粉在一定程度上延緩了卵巢器官的衰老萎縮，這也為維持機(jī)體內(nèi)雌性激素和孕激素正常分泌水平創(chuàng)造基礎(chǔ)。

丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反產(chǎn)生的氧化終產(chǎn)物，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。粉低組和粉高組小鼠經(jīng)過胎盤凍干粉灌胃干預(yù)后，大腦和肝臟中的MDA含量基本維持在正常水平，沒有出現(xiàn)像衰老組明顯升高的趨勢。陳水親等[8]研究發(fā)現(xiàn)胎盤中所含的免疫調(diào)節(jié)因子可以促使機(jī)體SOD活性升高，這樣就有利于減少過氧化物的形成，也可能是抑制胎盤粉組D-半乳糖致衰小鼠機(jī)體MDA水平升高的主要因素之一。

雌性哺乳動物體內(nèi)所分泌的雌二醇和孕酮等對于促進(jìn)性器官發(fā)育成熟，維持正常生理機(jī)能具有重要作用，催乳素則發(fā)揮啟動和維持泌乳作用。胎盤作為雌性哺乳動物在懷胎時為胎兒供應(yīng)養(yǎng)分的重要器官，同時也會分泌類似卵巢產(chǎn)生的激素以保證妊娠的進(jìn)行，所以其凍干粉中含有大量的促性腺激素和雌性激素[9]，提高了血液中相關(guān)激素的含量水平，對于延緩卵巢衰老起到重要作用，維持和促進(jìn)卵巢繼續(xù)行使分泌雌激素的功能。

EPO是哺乳動物調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的主要調(diào)控因子，能夠刺激骨髓造血功能，及時有效地增加紅細(xì)胞的數(shù)量，從而提高血液的攜氧能力。G-CSF主要作用是促進(jìn)骨髓HSC/HPC增殖分化成粒細(xì)胞集落，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的終末分化[10]。M-CSF刺激骨髓造血祖細(xì)胞形成巨噬細(xì)胞集落并促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的生存、增殖及成熟[11]。在懷胎期間，母體胎盤會分泌包括EPO和CSF在內(nèi)的多種胎盤生長因子和造血相關(guān)因子[12]，能夠滋養(yǎng)細(xì)胞生長[13]，維持臍血造血功能[14]。在胎盤凍干粉內(nèi)同樣也含有多種細(xì)胞生長因子成分[15]，有利于維持血液中所含EPO、G-CSF、M-CSF的濃度，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的分化為不同功能的免疫細(xì)胞。

機(jī)體內(nèi)成熟T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫階段的主要作用細(xì)胞，通過釋放淋巴因子和與靶細(xì)胞特異性結(jié)合來完成免疫應(yīng)答，一般分為CD 4+和CD 8+細(xì)胞兩大類群。T淋巴細(xì)胞的成熟分化主要在胸腺內(nèi)完成，胸腺器官功能的完好對于促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞CD 4+和CD 8+淋巴細(xì)胞的增殖和活性的維持具有重要意義。同時胎盤也會分泌多種白介素因子如IL-4、IL-10等[16]，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的分化和抗體的產(chǎn)生，從粉低組和粉高組的CD 4+和CD 8+細(xì)胞比例和血漿IgG含量可以看出，胎盤凍干粉所含的活性物質(zhì)有利于提高機(jī)體免疫力。

從實(shí)驗(yàn)總體結(jié)果來看，胎盤凍干粉通過灌胃途徑進(jìn)入小鼠機(jī)體后，與免疫力和生理調(diào)節(jié)相關(guān)的指標(biāo)基本優(yōu)于衰老組，甚至要優(yōu)于空白組和陽性組，說明胎盤凍干粉對于延緩機(jī)體衰老具有積極作用。在今后的實(shí)驗(yàn)中還需要對胎盤粉中具體成分的種類和活性進(jìn)行分析，同時進(jìn)一步闡述延緩衰老作用方面的調(diào)控途徑。

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Anti-aging function of placenta freeze-dried powder on mice

SONG Hang1, ZANG Chuan-bao1, LIU Xiao-dun1, HOU Huai-shui1, LI Dong1,2△
(1.Shangdong Qilu Stem Cells Co. Ltd, Jinan 250000, China; 2. Cryomedicine Lab , Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

ObjectiveTo investigate Anti-aging function of Placenta freeze-dried powder on mice。Method2 month old female-KM mice were divided into fi ve groups: normal control group, aging model group, positive control group, placenta freeze-dried powder low dose group and high dose group. Except normal control group，the rest of groups were treated with method of subcutaneous continuous injection of D-galactose for 42 days in order to establish mice aging model. Meanwhile, the corresponding drugs, via intragastric administration, were ingested by different treated groups and observe the change of immunity and physiological regulation related in mice。ResultsCompared with aging model group, thymus index and spleen index in placenta freeze-dried powder low dose group and high dose group increased obviously (P＜0.05), content of MDA in brain decreased signi fi cantly (P＜0.05), proportion of CD 4 and CD 8 lymphocyte in total lymphocyte, female hormone(P and E 2), IgG and haemopoietic factor in peripheral blood increased remarkably。ConclusionPlacenta freeze-dried powder could slow the aging process on mice via immunity enhancement and improving physical regulation.

placenta freeze-dried powder; D-galactose; anti-aging

R 285.5

B

1005-1678(2014)01-0065-03

宋航，男，碩士，研究方向：細(xì)胞免疫，E-mail:sh 1987827@ hotmail.com；李棟，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：再生醫(yī)學(xué)，E-mail:664192194@qq.com。