張小文,吳靜,2

(1.焦作市婦幼保健院藥劑科, 河南 焦作454000；2.吉林大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，吉林 長春 130000）

整合素受體介導(dǎo)共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體的構(gòu)建及其抗腫瘤研究

張小文1,吳靜1,2

(1.焦作市婦幼保健院藥劑科, 河南 焦作454000；2.吉林大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，吉林 長春 130000）

目的制備整合素受體精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）修飾共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體（RGDLP-PTX/Cu），研究其卵巢癌細(xì)胞靶向性以及對卵巢癌的治療效果。方法采用薄膜分散法制備RGD修飾共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體（RGDLP-PTX/Cu）。觀察脂質(zhì)體的粒徑，電位以及包封率;通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)研究卵巢癌細(xì)胞(A2780)對普通脂質(zhì)體（LP）和RGD修飾脂質(zhì)體（RGDLP）的攝取效率。流式細(xì)胞儀檢測不同載藥脂質(zhì)體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;構(gòu)建卵巢癌裸鼠異位模型，考察不同載藥脂質(zhì)體對腫瘤生長抑制作用。結(jié)果RGDLP-PTX/Cu的粒徑在（94.8±11.2）nm，電位為（-3±2.45）mV，PTX與Cu的包封率分別為81.8%和84.6%。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A2780細(xì)胞對RGDLP的攝取效率是LP的3.6倍;凋亡實(shí)驗(yàn)表明RGDLP-PTX/Cu誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的能力顯著強(qiáng)于RGDLP-PTX、RGDLP-Cu和LP-PTX/Cu(P＜0.01);荷瘤裸鼠腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：RGDLP-PTX/Cu具有良好的抗卵巢癌作用(P＜0.01)。結(jié)論RGD修飾共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體具有良好的卵巢癌細(xì)胞靶向性和抗卵巢癌作用，是一種潛在高效的卵巢癌靶向給藥系統(tǒng)。

整合素受體;紫杉醇;姜黃素;脂質(zhì)體

卵巢癌發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤發(fā)病率的第3位， 然而其死亡率卻居首位[1]。晚期卵巢癌患者長期生存率仍不超過20%[2]?；熓悄壳奥殉舶┑闹匾委熓侄沃唬颊叩挠笤诤艽蟪潭壬先Q于其對化療的反應(yīng)率。但是由于一般化療藥物具有極大的毒副作用，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對正常細(xì)胞也有很大的影響，導(dǎo)致患者對化療的順應(yīng)性低下，因此，我們需要一種新的治療途徑來提高病人的化療順應(yīng)性并殺滅腫瘤細(xì)胞，靶向治療便顯得尤為重要。

靶向給藥系統(tǒng)是指借助載體、配體或抗體將藥物通過局部給藥胃腸道、或全身血液循環(huán)而選擇性地濃集定位于靶組織、靶器官、靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的給藥系統(tǒng)[3]。脂質(zhì)體是靶向給藥系統(tǒng)的代表，它是由磷脂組成的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的球形結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性，能夠通過內(nèi)核包載親脂性藥物和親水性藥物，脂質(zhì)體還能夠進(jìn)行表面修飾，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向[4]。有研究表明，卵巢癌細(xì)胞(A2780)表面有大量的整合素受體表達(dá)[5]，因此本研究將整合素受體特異性配體RGD連接到脂質(zhì)體表面，以紫杉醇和姜黃素為模型藥物構(gòu)建了卵巢癌靶向給藥脂質(zhì)體，對其卵巢癌細(xì)胞靶向性以及對卵巢癌的治療效果進(jìn)行評價(jià)。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 SizerNano ZS 90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀（英國Malvern instruments Ltd）。大豆磷脂（SPC，上海太偉藥業(yè)有限公司）；DSPE-PEG 2000（美國Avanti polar lipids）；羅丹明標(biāo)記磷脂（美國Avanti polar lipids）；DSPE-PEG 2000-MAL (美國Avanti polar lipids)；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；紫杉醇（連云港恒瑞藥業(yè)）；姜黃素（美國sigma）；胎牛血清（美國GIBCO公司）。人源卵巢癌細(xì)胞（A2780，上海細(xì)胞研究所)。

1.2 方法

1.2.1 RGD修飾共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體的制備及其表征 參照文獻(xiàn)[6-7]方法合成RGD-PEG 2000-DSPE.精密稱取SPC 15.12 mg，膽固醇1.35 mg，DSPE-PEG 2000-OMe 1.25 mg，RGD-PEG 2000-DSPE 0.35 mg，紫杉醇0.30 mg，姜黃素0.25 mg，將以上材料和藥物溶于氯仿中，在茄形瓶中減壓蒸餾成膜，除去有機(jī)溶劑，置于真空干燥器中過夜，使其充分干燥，加入2 mL PBS水化，探頭超聲（80 W，10 s，10 s，5次）得到RGDLP-PTX/Cu。采用相同的方法制備RGDLP-PTX、RGD-LP-Cu、LP-PTX/Cu。用1.08 mg羅丹明標(biāo)記的磷脂取代相同量的SPC制備羅丹明標(biāo)記的熒光脂質(zhì)體。參照文獻(xiàn)[8-9]的方法測定紫杉醇和姜黃素的包封率。

1.2.2 A 2780卵巢癌細(xì)胞對RGD修飾脂質(zhì)體的攝取 將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量不載藥LP和RGDLP使孔中羅丹明濃度為0.15 nmol/mL，37℃分別孵育2 h和4 h后除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)基，冷PBS清洗2次，每孔加入1%triton，裂解細(xì)胞，暗處放置30 min，用熒光分光光度計(jì)測定熒光值。為了定性觀察細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取，將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗3次，加入2μg/mL DAPI溶液，室溫孵育30 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取。

1.2.3 RGD修飾共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡 為了定量檢測不同脂質(zhì)體引起的腫瘤細(xì)胞凋亡，培養(yǎng)A 2780細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時(shí)加入無菌過濾后的脂質(zhì)體，使每孔的最終脂質(zhì)濃度為6.5μmol/mL。將孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)后24 h收集細(xì)胞，用冰PBS清洗細(xì)胞3次，F(xiàn)ITC/PI雙染，細(xì)胞避光放置15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 卵巢癌異位腫瘤模型的構(gòu)建及其抗腫瘤研究

A2780細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個(gè)/mL。取4～6周齡，體重20～25 g的雌性裸鼠，將準(zhǔn)備好的A2780細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 mL細(xì)胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。

將優(yōu)選后的50只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為RGDLP-PTX組、RGDLP-Cu組、LP-PTX/Cu組、RGDLP-PTX/Cu組和生理鹽水組。荷瘤裸鼠每天觀察其活動(dòng)度和飲食習(xí)慣，第21天后剖腫瘤，稱重，計(jì)算抑瘤率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的表征 取制備得到的RGDLP-PTX/Cu用馬爾文激光粒度儀測定粒度和zeta電位，平行測定3次。結(jié)果顯示RGDLP-PTX/Cu的平均粒徑為（94.8±11.2）nm，多分散性系數(shù)為0.12，粒度分布見圖1。平均zeta電位為（-3±2.45）mV。PTX與Cu的包封率分別為81.8% 和84.6%。

2.2 RGDLP的體外腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 在A2780細(xì)胞表面整合素受體高度表達(dá)。細(xì)胞攝取的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1）顯示：A2780細(xì)胞對RGDLP攝取效率是普通脂質(zhì)體的3.6倍。由于測得熒光值為扣除空白后的細(xì)胞內(nèi)熒光值，因此，本研究采用細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度表示攝取效率。定性的激光共聚焦熒光顯微鏡觀察結(jié)果（見圖2）所示，RGDLP組熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于普通脂質(zhì)體，這與定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖1 RGDLP-PTX/Cu的粒徑分布圖Fig.1 The diagram of size of RGDLP-PTX/Cu

表1 A 2780細(xì)胞對不同脂質(zhì)體的攝取效率（n=3）Tab.1 Uptake of different liposomes by A 2780 cells (n=3)

圖2 激光共聚焦觀察A 2780細(xì)胞對羅丹明標(biāo)記脂質(zhì)體的攝取.Fig.2 Uptake of rhodamine labelled liposomes by A 2780 cells based on confocal laser scanning microscopy

2.3 RGDLP-PTX/Cu誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡 腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RGDLP-PTX/Cu組、RGDLP-PTX組、RGDLP-Cu組和LP-PTX/Cu組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率為54.8%、39.7%、21.5%和23.7%，而生理鹽水組早期凋亡率為0.58%。與生理鹽水組相比，RGDLP-PTX/Cu組、RGDLPPTX組、RGDLP-Cu組和LP-PTX/Cu組均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與RGDLP-PTX組、RGDLP-Cu組和LP-PTX/Cu組相比，RGDLP-PTX/Cu能夠增加腫瘤細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖3）。

圖3 不同載藥脂質(zhì)體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率**P＜0.01， 與RGDLP-PTX組、RGDLP-Cu組和LP-PTX/Cu組相比；△P＜0.01，與生理鹽水比較Fig.3 The effect of drugs induced cells apoptotic**P＜0.01，Compared with RGDLP-PTX group， RGDLP-Cu group and LP-PTX/Cu group；△P＜0.01，Compared with saline group

2.4 RGDLP-PTX/Cu對卵巢癌異位瘤的生長抑制作用 荷瘤裸鼠治療實(shí)驗(yàn)以生理鹽水組為對照，RGDLP-PTX/ Cu組、RGDLP-PTX組、RGDLP-Cu組和LP-PTX/Cu組對腫瘤生長的抑制率分別為（71.4±7.5）%、（52.5±7.2）%、（19.3±3.3）%和（33.7±4.9）%，RGDLP-PTX/Cu組與其他組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表2）。

表2 不同藥物干預(yù)對腫瘤生長的抑制率（n=5）Tab. 2 The effect of different drugs inhibit the growth of tumor (n=5)

3 討論

紫杉醇是來源于紅豆杉屬太平紫杉的一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，被廣泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫瘤和非小細(xì)胞肺癌的治療[10]。紫杉醇難溶于水及多種藥用溶媒，目前國內(nèi)外多采用聚氧乙基代蓖麻油與無水乙醇作為混合溶劑制成注射劑，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，從而使紫杉醇的臨床應(yīng)用受到一定的限制。姜黃素是從中藥姜黃中提取的活性成分。近年來姜黃素被廣泛用于抗前列腺癌[11]、肝癌[12]、腦膠質(zhì)瘤[13]、結(jié)腸癌[14]以及卵巢癌[15]的治療研究。理想的腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)不僅需要在全身給藥后將藥物濃集在腫瘤組織，而且還需要將藥物高效地傳遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而將治療作用最大化并減少抗腫瘤藥物的副作用。腫瘤組織內(nèi)部由于血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差、淋巴回流缺失，造成納米顆粒在此具有選擇性高通透性和滯留性，這種現(xiàn)象被稱作腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（Enhanced permeability and retention effect），簡稱EPR效應(yīng)[16-17]。有研究證實(shí)，腫瘤表面和內(nèi)皮血管表面都大量表達(dá)了整合素受體α v β 3[14]，RGD是一種能夠與整合素受體特異性結(jié)合的環(huán)狀三肽，本研究將RGD連接到包載紫杉醇和姜黃素的脂質(zhì)體表面，靶向抑制卵巢癌。目前鮮見共載紫杉醇和姜黃素藥物載體系統(tǒng)的報(bào)道。

本研究顯示，制備得到的脂質(zhì)體的粒徑為95 nm左右，紫杉醇和姜黃素的包封率都大于80%。經(jīng)過RGD修飾后能夠顯著增強(qiáng)A2780卵巢癌細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取。定性的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)也與定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)果RGD修飾后共載藥脂質(zhì)體對A2780卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性強(qiáng)于未修飾的共載藥脂質(zhì)體，這與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，這說明RGD修飾的載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞增殖抑制作用依賴于細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取，經(jīng)過RGD修飾后，腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取增強(qiáng)，細(xì)胞毒性增強(qiáng)。共載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性強(qiáng)于紫杉醇脂質(zhì)體和姜黃素脂質(zhì)體，這說明，紫杉醇和姜黃素的共載能夠有效發(fā)揮兩者藥物抗腫瘤的協(xié)同作用。綜上所述，本研究制備的RGD修飾共載紫杉醇和姜黃素脂質(zhì)體是一種潛在有效的卵巢癌細(xì)胞靶向給藥系統(tǒng)。

[1] Despierre E,Lambrechts D,Neven P,et al.The molecular genetic basis of ovarian cancer and its roadmap towards a better treatment[J].Gynecol Oncol,2010,117(2)：358-365.

[2] Shahzad MK,Shin YH.Biological significance of HORMA domain containing protein 1 (HORMAD 1) in epithelial ovarian carcinoma[J].Cancer Lett,2013,330(2)：123-129.

[3] Chang J,Jallouli Y,Kroubi M,et al.Characterization of endocytosis of transferrin-coated PLGA nanoparticles by the blood-brain barrier[J].Int J Pharm,2009,379(2)：285-292.

[4] Qian ZM,Li H,Sun H,et al.Targeted drug delivery via the transferring receptor-mediated endocytosis pathway[J].Pharmacol Rev,2002,54(4)：561-587.

[5] Jiang XY.Solid tumor penetration by integrin-mediated pegylatedpoly (trimethylene-carbonate) nanoparticles loaded with paclitaxel[J].Biomaterials, 2013(34)：1739-1746.

[6] Kuai R.Efficient Delivery of Payload into Tumor Cells in a Controlled Manner by TAT and Thiolytic Cleavable PEG Co-Modified Liposomes[J].Mol.Pharmaceutics 2010,7(5)：1816-1826.

[7] Yao Q.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for enhancing the brain delivery[J].International Journal of Pharmaceutics，2011,419(1)：85-95.

[8] 楊濤.紫杉醇脂質(zhì)體藥物含量及包封率的測定[J].藥物分析雜志，2008,28（2）：231-233.

[9] 李建林.透明質(zhì)酸磷脂酰衍生物修飾姜黃素脂質(zhì)體的制備及細(xì)胞毒性[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013,44(5)：471-474.

[10] Shah N.Paclitaxel-loaded PLGA nanparticles surface modified with transferrin and Pluronic P 85,an in vitro cell line and in vivo biodistribution studies on rat model[J].J Drug Target，2009,(17)：533-542.

[11] 劉立民.姜黃素對前列腺癌PC-3 M 細(xì)胞生長抑制和凋亡的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2007,33（2）：283-285.

[12] 王偉章.姜黃素對人肝癌細(xì)胞Sk-hep-1抗癌作用的研究[J].中國中藥雜志,2010,35（4）：485-488.

[13] 劉特.姜黃素對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡作用及其對Bcl-2與Caspase 8誘導(dǎo)表達(dá)的影響[J].中國癌癥雜志,2009,19（4）：247-251.

[14] 盧偉東.姜黃素逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌裸鼠移植瘤多藥耐藥的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,33（4）：376-380.

[15] 鄭麗端.姜黃素誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株A 2780凋亡及其分子機(jī)制的研究[J].癌癥，2002,21（12）：1296-1300.

[16] Vladimir T.Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect[J]. AdvDrug Deliv Rev,2011,(63)：3131-3135.

[17] H Maeda.Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics：a review[J].J Control Release,2000,(65)：271-284.

The study of RGD modi fi ed paclitaxel and curcumin loaded liposome for the treatment of ovarian carcinoma in vitro and in vivo

ZHANG Xiao-wen1, WU Jing1,2
（1. Jiaozuo Maternal and Child Care Service Center of Henan Province, Jiaozuo 454000, China; 2 . The Third Clinical Medical School of Jilin University，Changchun 130000, China）

ObjectiveTo prepare RGD conjugated paclitaxel and curcumin loaded liposome and evaluate their properties and effect on the treatment of ovarian carcinoma in vitro and in vivo 。MethodThe liposomes were prepared by thin fi lm hydration method. The particle size，Zeta potential and entrapment ef fi ciency were evaluated. The ef fi ciency of cellular uptake on A 2780 cells in vitrowas evaluated. Flowcytometry were used to observe the apoptosis morphous.A 2780 cells werexenografted in athymic mice to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-cancer。ResultsThe particle diameter of the RGDLP-PTX/Cu was (94.8±11.2) nm with the Zeta potential of (-3±2.45) mV. The entrapment ef fi ciency of PTX and Gen were 81.8% and 84.6% respectively. The result demonstrated that RGDLP uptaken by A 2780 were 3.6 times higher than that of LP. The apoptosis assay、the inhibition of the inhibition of tumor in vivocon fi rmed strong inhibitory effect ofRGDLP-PTX/Cu。ConclusionRGDLP-PTX/Cu were easy to prepare and it is a potential delivery system for the treatment of ovarian carcinoma.

integrin receptor；paclitaxel；curcumin；liposome

R 943

A

1005-1678(2014)01-0062-03

張小文，男，副主任藥師，研究方向：藥物新劑型與新制劑，Email：529827419@qq.com。