鮑建勛,王號(hào)飛,黃云娟

（舟山醫(yī)院 藥劑科，浙江 舟山202451 ）

人參皂苷R g 3聯(lián)合奧沙利鉑和索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

鮑建勛,王號(hào)飛,黃云娟

（舟山醫(yī)院 藥劑科，浙江 舟山202451 ）

目的探討人參皂苷Rg3聯(lián)合奧沙利鉑和索拉非尼對(duì)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的影響。 方法 分別將人參皂甙Rg 3、索拉菲尼、奧沙利鉑3種藥物分為單藥、兩藥聯(lián)合、和三藥聯(lián)合作用于人肝癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖情況、早期凋亡情況、中晚期凋亡情況。結(jié)果 3種藥物聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率、細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)顯著高于單用一種藥物以及兩種藥物聯(lián)用（P＜0.01）。 結(jié)論 聯(lián)合人參皂苷Rg 3、奧沙利鉑以及索拉菲尼能夠顯著提高肝癌細(xì)胞的凋亡率。

人參皂苷Rg 3；奧沙利鉑；索拉非尼；肝癌細(xì)胞；凋亡

原發(fā)性肝癌是臨床常見(jiàn)腫瘤，患者多預(yù)后差。原發(fā)性肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，因此藥物治療是中晚期原發(fā)性肝癌的主要治療方法之一。奧沙利鉑、索拉菲尼等是近年來(lái)涌現(xiàn)的一些新藥，能夠一定程度上改善患者的療效[1-2]。人參皂苷Rg3是從人參中提取的成份，具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[3]。本實(shí)驗(yàn)主要研究人參皂甙Rg3、奧沙利鉑、索拉菲尼三種藥物單獨(dú)和聯(lián)合使用時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 試驗(yàn)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞株（購(gòu)買(mǎi)于上海艾研生物科技有限公司）。根據(jù)不同作用藥物分組。其中人參皂苷Rg3作用組簡(jiǎn)稱人組，奧沙利鉑作用組簡(jiǎn)稱奧組，索拉菲尼作用組簡(jiǎn)稱索組，人參皂苷Rg3聯(lián)合奧沙利鉑組簡(jiǎn)稱人奧組，人參皂苷Rg3聯(lián)合索拉菲尼組簡(jiǎn)稱人索組，奧沙利鉑聯(lián)合索拉菲尼組簡(jiǎn)稱奧索組，人參皂苷Rg3聯(lián)合奧沙利鉑和索拉菲尼在胃人奧索組。另設(shè)陰性對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)液和藥物儲(chǔ)存液的配置 培養(yǎng)液：加10% 胎牛血清和1%青鏈霉素于RPMI-1640培養(yǎng)基。索拉菲尼藥物儲(chǔ)存液：索拉菲尼碾碎，去包衣，溶于100%DMSO中，過(guò)濾除菌，凍存。奧沙利鉑藥物儲(chǔ)存液：溶于葡萄糖水中，凍存。人參皂苷Rg3藥物儲(chǔ)存液：溶解于無(wú)菌蒸餾水中，凍存。藥物儲(chǔ)存液使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋，奧沙利鉑濃度為1 μg/mL，索拉菲尼濃度為1 μ mol/L，人參皂苷Rg3濃度為30 μg/mL。

1.2.2 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)傳代 肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇，接種與培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)液，PBS液沖洗培養(yǎng)瓶壁，加入含EDTA的胰蛋白酶消化，細(xì)胞出現(xiàn)間隙時(shí)洗出胰蛋白酶，加入培養(yǎng)液中止消化。細(xì)胞混懸液取出后離心，棄去上清，加培養(yǎng)液，1∶5傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 各組細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。24 h后加入相應(yīng)藥物。陰性對(duì)照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL?？瞻捉M加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入5 mg/mL MTT液，孵育4 h，加入DMSO，震蕩后，測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度。細(xì)胞增殖抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值-空白孔平均吸光度值）/（陰性對(duì)照組平均吸光度值-空白孔平均吸光度值）]×100%。

1.3.2 細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，加入相應(yīng)的藥物300 μ L，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。48 h后收集上清液于流式管，6孔板內(nèi)加不含EDTA的消化液，細(xì)胞變圓、出現(xiàn)細(xì)胞間隙后終止消化，收集入流式管，離心，收集細(xì)胞，PBS液沖洗，離心后棄去上清，加入Bingding Buffer 500 μL重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 10 μ L，加入 Propidium Iodide 5 μL，混勻，避光，室溫反應(yīng)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.3 細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種在6孔板內(nèi)，6孔板裝有滅菌蓋玻片。培養(yǎng)，爬片

24 h。加入相應(yīng)的藥物300 μL，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)

48。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件數(shù)據(jù)處理，正態(tài)計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表達(dá)，采用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制情況 3種藥物聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率顯著高于單用1種藥物以及2種藥物聯(lián)用的抑制率（P＜0.01，見(jiàn)表1）。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制情況Tab.1 Iinhibition results of cell proliferation

2.2 細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù) 各組細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)Tab.2 Aapoptosis rate and apoptotic index

3 討論

凋亡是細(xì)胞程序化死亡，癌癥的發(fā)生發(fā)展與癌癥細(xì)胞凋亡程序異常有關(guān)，腫瘤與凋亡受抑和過(guò)度增殖具有密切的相關(guān)性，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞凋亡減少,而藥物能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而達(dá)到治療的目的[4-5]。凋亡相關(guān)的基因包括Bcl-2基因家族、Caspase家族等[6]。Bcl-2是抑制凋亡的基因，阻止細(xì)胞的凋亡，具有致癌作用[7]。Bax是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，與Bcl-2有拮抗作用，兩者共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的凋亡。Caspase家族中Caspase-3在凋亡執(zhí)行方面發(fā)揮重要的作用，活化的Caspase-3能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。

奧沙利鉑屬于新的鉑類抗癌藥，通過(guò)產(chǎn)生烷化結(jié)合物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA的合成，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用和抗腫瘤活性[9]。研究顯示:奧沙利鉑可通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的HCCLM3和Hep3 B細(xì)胞凋亡，其通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。在本次研究中，使用奧沙利鉑的肝癌細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組。索拉非尼是一種新型多靶向性的治療腫瘤的口服藥物，是一種多激酶抑制劑，能同時(shí)抑制多種存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的激酶，包括RAF激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（VEGFR-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3（VEGFR-3）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體－β（PDGFR－β）、KIT和FLT-3，可以通過(guò)抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，直接抑制腫瘤生長(zhǎng)；又可通過(guò)抑制VEGFR和PDGFR而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10-11]。在本次研究中，索拉菲尼組的細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組。人參皂苷Rg3是人參中的有效活性成分，是一種人參二醇類四環(huán)三萜皂苷, 具有較好的抗癌、抗癌轉(zhuǎn)移作用[12]。Rg3能顯著提高荷瘤小鼠的免疫功能；抑制腫瘤內(nèi)新生血管形成；阻止脫落癌細(xì)胞在血管壁的著床；抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)血管壁基底膜的浸潤(rùn)，有顯著抗浸潤(rùn)、抗轉(zhuǎn)移作用。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí):Rg3能有效抑制肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌生長(zhǎng)，明顯改善臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、預(yù)防和治療癌癥[13-14]。主要作用于G2期，有效抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂前期蛋白質(zhì)和ATP的合成，使腫瘤細(xì)胞增殖速度減慢。人參皂甙Rg3可選擇性抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)腫瘤還有抗轉(zhuǎn)移的作用，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，提高免疫功能等[15]。在本次研究中，使用人參皂苷Rg3組的細(xì)胞凋亡率和凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組。分別兩藥聯(lián)合的各組中，奧沙利鉑和人參皂苷Rg3聯(lián)合以及奧沙利鉑和索拉菲尼聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用相似，高于索拉菲尼聯(lián)合Rg3組。將三者聯(lián)合后，肝癌細(xì)胞的抑制率最高，肝癌細(xì)胞的凋亡率和抑制指數(shù)也最高，說(shuō)明三者聯(lián)合能夠顯著提高療效。

綜上所述，聯(lián)合人參皂苷Rg 3、奧沙利鉑以及索拉菲尼能夠顯著提高肝癌細(xì)胞的凋亡。本文的研究不足之處在于本研究為實(shí)驗(yàn)研究，3種藥物同時(shí)使用是否會(huì)增加不良反應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。

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Effect of Ginsenoside-Rg combined with oxaliplatin and sorafenib on hepatic carcinoma cell apoptosis

BAO Jian-xun,WANG Hao-fei,HUANG Yun-juan
(Pharmacy Department, Zhoushan Hospital, Zhoushan 202451, China)

ObjectiveTo discuss the effect of Ginsenoside-Rg combined with oxaliplatin and sorafenib on hepatic carcinoma cell apoptosis。MethodGinsenoside-Rg, oxaliplatin and sorafenib were divided into single drug group, two drugs group and three drugs group to act on hepatic carcinoma cell. Multiplication, prophase apoptosis, middle and advanced stage apoptosis were observed。ResultsTo combine three drugs could improve hepatic carcinoma cell inhibition ratio, apoptosis ratio, apoptotic index compared to those of two drugs group or single drugs group（P＜0.01）。ConclusionTo combine Ginsenoside-Rg, oxaliplatin and sorafenib can improve hepatic carcinoma cell inhibition ratio.

Ginsenoside-Rg; oxaliplatin; sorafenib; hepatic carcinoma;apoptosis

R 735.7

A

1005-1678(2014)01-0041-03

鮑建勛，男，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：550952840@qq.com。