王斌，馬瑜紅，胡清茹，田林燕，張華勛，阮耀，梁桂娜

（南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 南陽 473000）

燈盞細辛注射液對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的保護作用研究

王斌，馬瑜紅，胡清茹，田林燕，張華勛，阮耀，梁桂娜

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473000）

目的探討燈盞細辛注射液對缺血-再灌注腎臟損傷的保護作用，為臨床防治腎缺血-再灌注損傷提供理論依據(jù)。方法36只SPF級健康雄性SD大鼠，隨機均分為3組（n=12）。A組：缺血-再灌注組;B組：燈盞細辛注射液預(yù)處理組;C組：假手術(shù)組。A、C組大鼠腹腔注射生理鹽水，B組大鼠腹腔注射燈盞細辛注射液12 mg/kg。14天后比較3組大鼠腎功能指標、腎抗氧化指標、腎組織細胞凋亡指數(shù)以及腎組織Bcl-2、Bax表達情況。結(jié)果B組血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐(serum creatinine，SCr)顯著低于A組（P＜0.05），且顯著高于C組（P＜0.05）;同時，B組超氧岐化酶（superoxide dismutase，SOD）顯著高于A組（P＜0.05）而顯著低于C組（P＜0.05），B組丙二醛（malondialdehyde，MDA）顯著低于A組（P＜0.05）而顯著高于C組（P＜0.05）;腎組織細胞凋亡指數(shù)結(jié)果顯示：B組細胞凋亡指數(shù)AI極顯著低于A組（P＜0.01）而顯著高于C組（P＜0.01）;腎組織Bcl-2、Bax免疫組化染色結(jié)果顯示：B組Bcl-2表達顯著高于A組與C組（P＜0.01），B組Bax表達顯著低于A組（P＜0.05）而顯著高于C組（P＜0.01），B組Bcl-2/Bax值顯著高于A組與C組（P＜0.05）。結(jié)論燈盞細辛注射液可能通過抗氧化和抗凋亡作用對腎臟缺血-再灌注損傷起到保護作用。

燈盞細辛注射液;腎臟;缺血-再灌注

1.2 實驗分組及造模 取36只SPF級健康雄性SD大鼠，隨機分為3組，每組12只。A組：缺血-再灌注組；B組：燈盞細辛注射液預(yù)處理組；C組：假手術(shù)組。A、C組大鼠腹腔注射生理鹽水，B組大鼠腹腔注射燈盞細辛注射液12 ml/kg。各組每天給藥1次，連續(xù)14 d。第14天給藥后1 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，行腹正中切口，暴露雙側(cè)腎臟并游離雙側(cè)腎蒂，用0號線結(jié)扎右腎腎蒂，切除右腎。而A、B組用無創(chuàng)動脈夾夾閉左側(cè)腎動脈60 min，然后開放動脈血流。若腎臟由暗紅變?yōu)轷r紅，表明再灌注成功，隨后縫合腹腔。C組不夾閉左側(cè)腎蒂，僅切除右側(cè)腎臟，暴露60 min后再關(guān)閉腹腔。各組于24 h后麻醉大鼠，采血并摘取左腎。血標本以4000 r/min離心10 min，分離血清，置-20℃保存用于測定血尿素氮（BUN）和血肌酐(SCr)。取部分腎組織用40 g/L甲醛固定以制備石蠟切片。

1.3 檢測指標 (1)腎功能測定：用紫外分光光度計測定BUN（二乙酰-肟顯色法）和SCr（堿性苦味酸比色法）水平；(2)腎抗氧化指標檢測：按照試劑盒要求測定MDA含量和SOD活性；(3)腎組織細胞凋亡檢測：采用TUNEL檢測，操作步驟按照TUNEL試劑盒說明書進行， 使用DAB試劑盒顯色，光鏡觀察凋亡細胞，若細胞核中有棕黃色顆粒則為陽性細胞。在陽性表達的分布區(qū)域、。使用200倍隨機選擇5個無重疊視野，對陽性細胞進行計數(shù)，計算細胞凋亡指數(shù)（AI)以凋亡陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示：凋亡陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。(4)腎組織Bcl-2、Bax免疫組化染色：操作步驟按照Bcl-2和Bax試劑盒進行，采用DAB試劑盒顯色。在光鏡下觀察，若胞質(zhì)中含有棕色顆粒者作為陽性細胞。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析處理，正態(tài)計量資料采用“x±s”表示，2組間比較采用兩樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能測定結(jié)果 尿素氮（BUN）3組比較差異具有顯著性意義（F=91.287，P=0.000）；血肌酐（SCr）值3組比較差異具有顯著性意義（F=227.472，P=0.000，見表1）。

表1 各組大鼠腎功能測定結(jié)果比較（n=12）Tab. 1 Comparison of renal function test results in three groups（n=12）

2.2 各組大鼠腎抗氧化指標檢測結(jié)果 3組大鼠腎組織勻漿中超氧岐化酶（SOD）比較差異具有顯著性意義（F=46.398，P=0.000）；3組大鼠腎組織勻漿中丙二醛（MDA）比較差異具有顯著性意義（F=158.392，P=0.000，見表2）。

表2 各組大鼠腎抗氧化指標比較結(jié)果（n=12）Tab.2 Comparison of renal antioxidant index results in three group（n=12）

2.3 腎組織細胞凋亡監(jiān)測結(jié)果 A組大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)顯著高于B組、C組（F=262.381，P=0.000，見表3、圖1)。

表3 各組大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)比較（n=12）Tab.3 Comparison of renal cell apoptosis index results in three group（n=12）

圖1 各組腎小管上皮細胞凋亡TUNEL染色圖①A組：缺血-再灌注組；②B組：燈盞細辛注射液預(yù)處理組；③C組：假手術(shù)組Fig. 1 TUNEL staining results of renal tubular epithelial cell apoptosis in each group①Group A：ischemia reperfusion group；②Group B：Erigeron breviscapus injection preconditioning group；③ Group C：sham operation group

2.4 大鼠Bcl-2、Bax表達情況 C組大鼠Bcl-2和Bax表達顯著低于A組、B組（P＜0.05）；A組大鼠Bcl-2/Bax表達顯著低于B組、C組（P＜0.05，見表4）。

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax表達的比較結(jié)果（n=12）Tab.4 Comparison of Bcl-2, Bax expression results in three groups（n=12）

3 討論

燈盞花屬于菊科短亭飛蓬屬植物，燈盞細辛注射液中其主要的成分有燈盞花乙素、二咖啡?？鼘幩狨ァ⒔柜强邓?、芹菜素、高黃芩素等黃酮類的化合物。有藥理研究表明其具有著降低血液粘稠度、舒張血管、增加腦供血、改變血液流動性的功能，同時還能夠改善機體微循環(huán)、保護梗死區(qū)的組織、為梗死區(qū)增加血氧供應(yīng)并促進梗死區(qū)功能的恢復(fù)[3]。臨床實踐證明，燈盞細辛注射液能夠較好地治療腎臟缺血-再灌注損傷，但是其作用機制仍不清楚。

腎臟是一種高灌注器官，因此腎臟對于機體的缺血是非常敏感的，當機體血容量不足或者進行相關(guān)的手術(shù)時需要阻斷腎臟血流，當機體血流灌注恢復(fù)以后則可能發(fā)生腎臟缺血-再灌注損傷[4-5]。隨著臨床各種腎臟手術(shù)以及腎移植手術(shù)的開展，如何有效預(yù)防以及治療腎臟缺血-再灌注損傷成為了臨床工作中的一個難題，也成為了科研關(guān)注的一個焦點。本研究探討燈盞細辛對缺血-再灌注腎臟損傷的保護作用，為臨床防治腎缺血-再灌注損傷提供科學(xué)的理論依據(jù)。

BUN以及SCr為機體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，當機體的腎臟功能損傷到達一定程度時，由于機體失去了代償能力，從而造成了血液中BUN以及SCr的含量升高，因此血液中BUN以及SCr升高表明了腎臟的損傷更加嚴重[6-8]。本研究結(jié)果顯示，缺血-再灌注后大鼠血清BUN、SCr顯著升高，表明造模成功。燈盞細辛可顯著降低缺血-再灌注大鼠血清BUN和SCr水平，提示燈盞細辛注射液對腎功能具有保護作用[9]。SOD是一種自由基清除劑，能夠有效反映出機體清除氧自由基的能力，通過測定SOD的活性能夠反映出腎臟抗脂質(zhì)過氧化的能力；而MDA是一種脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，能夠反映出腎臟其脂質(zhì)過氧化的程度[10-11]，研究結(jié)果顯示，B組超氧岐化酶（SOD）顯著高于A組（P＜0.05）而顯著低于C組（P＜0.05），B組丙二醛（MDA）顯著低于A組（P＜0.05）而顯著高于C組（P＜0.05），表明了燈盞細辛注射液能夠增強腎臟抗氧化的能力，從而起到保護腎臟缺血-再灌注損傷的作用。

本研究采用TUNEL法檢測腎小管上皮細胞的凋亡，該方法是目前較為常用的一種方法，其靈敏度較高，且能夠準確標記出凋亡細胞[12-13]，研究結(jié)果顯示，B組細胞凋亡指數(shù)AI極顯著低于A組（P＜0.01）而極顯著高于C組（P＜0.01），表明了腎臟缺血-再灌注損傷將誘導(dǎo)細胞凋亡增加，而燈盞細辛注射液能夠有效減輕細胞的凋亡。由于細胞凋亡是在基因的調(diào)控作用下所產(chǎn)生的一種自我消亡的過程，本研究測定抗調(diào)亡基因Bcl-2蛋白以及促調(diào)亡基因Bax蛋白，Bcl-2可抑制細胞凋亡，而Bax加速細胞凋亡，Bcl-2以及Bax的比率決定了細胞的存活還是促進其凋亡[14-15]，研究結(jié)果顯示，腎組織Bcl-2、Bax免疫組化染色結(jié)果顯示，B組Bcl-2表達極顯著高于A組與C組（P＜0.01），B組Bax表達顯著低于A組（P＜0.05）而極顯著高于C組（P＜0.01），B組Bcl-2/Bax值顯著高于A組與C組（P＜0.05），提示燈盞細辛注射液通過上調(diào)Bcl-2而下調(diào)Bax，使

Bcl-2/Bax的比值上升，減少細胞的凋亡，發(fā)揮保護腎臟缺血-再灌注損傷的作用。

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Study of protective effect of erigeron injection on renal ischemia-reperfusion injury

WANG Bin, MA Yu-hong, HU Qing-ru, TIAN Lin-yan, ZHANG Hua-xun, RUAN Yao, LIANG Gui-na
（Nanyang Medical College，Nanyang 473000, China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of breviscapine on ischemia-reperfusion renal injury, which provides scientific theoretical basis for clinical prevention and treatment of renal ischemia-reperfusion injury。Method36 SPF male healthy SD rats were randomly divided into 3 groups, 12 rats in each group. Group A was ischemia-reperfusion group, group B was erigeron breviscapus injection preconditioning group, and group C was sham operation group. Rats in group A and C were injected with normal saline, while rats in group B were given 12 ml/ kg erigeron breviscapus injection by intraperitoneal injection., After 14 days, renal function, renal antioxidant indexes, renal cell apoptosis indexes and expression of Bcl-2, Bax in renal tissue of three groups were compared。ResultsThe indexes of renal function showed that blood urea nitrogen (BUN) and Serum creatinine (SCr) in group B were signi fi cantly lower than group A (P＜0.05), but signi fi cantly higher than group C (P＜0.05). Renal antioxidant indexes showed that superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in group B were signi fi cantly higher than group A (P＜0.05), but signi fi cantly lower than group C(P＜0.05). The index of renal cell apoptosis showed that the apoptosis index AI in group B was signi fi cantly lower than group A (P＜0.01), but signi fi cantly higher than group C (P＜0.01). The results of immunohistochemical staining showed that the expression of Bcl-2 in group B were signi fi cantly higher than that of group A and group C (P＜0.05), and the expression of Bax in group B was signi fi cantly lower than that in group A (P＜0.05) while signi fi cantly higher than group C (P＜0.01). The ratio of Bcl-2/Bax in group B was signi fi cantly higher than group A and group C (P＜0.05)。ConclusionErigeron Breviscapus Injection may have a protective role on renal ischemia reperfusion injury though antioxidant and anti-apoptosis.

erigeron breviscapus injection; kidney; ischemia reperfusion

R 285.5

A

1005-1678(2014)01-0038-03

腎缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）指的是缺血腎臟的血液供應(yīng)恢復(fù)后，可加重原有的單純?nèi)毖該p傷。在臨床工作中IRI是導(dǎo)致患者缺血性急性腎衰竭的一個重要原因。此類患者的病死率高，即便存活，患者也存在不同程度的慢性腎功能損傷。有研究結(jié)果顯示燈盞細辛注射液能夠降低損傷血瘀證模型大鼠其血清中的炎癥因子(如IL-1和TNF-α)的含量，從而減輕炎癥的程度；同時也具有止痛、抗凝以及提高免疫力、抗氧化等作用，并對腦缺血-再灌注大鼠的腦組織具有著明顯的保護作用[1-2]。在臨床工作中將此藥物運用于難治性腎病綜合征、IgA腎病以及慢性腎小球腎炎具有著良好的效果，但是在國內(nèi)的研究中該藥物對腎缺血-再灌注的相關(guān)報道較少。本研究探討燈盞細辛對缺血-再灌注腎臟損傷的保護作用，并探討作用機制，為臨床防治腎缺血-再灌注損傷提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 燈盞細辛注射液購自云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司（國藥準字Z 53021569），超氧岐化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）檢測試劑盒、蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。所用儀器主要包括全自動生化分析儀（日立7020）、紫外分光光度計（TU-1901），BM－Ⅷ生物組織包埋機及冷凍臺（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）、病理圖像分析儀（Leica DMR+Q 550型）、顯微鏡（Olympus BX-41）、熒光顯微鏡(Nikon E 200 F)。

南陽市科技攻關(guān)項目（2012 GG 073）

王斌，男，碩士，講師，研究方向：中藥藥理與臨床藥理學(xué)，E-mail：baomaxl@126.com。