羅衛(wèi)民，劉越峰，羅湘玉，張軍△，林稱意，郭家龍

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬十堰市太和醫(yī)院 心胸外科，湖北 十堰442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬十堰市人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

金櫻子對阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的保護作用及機制

羅衛(wèi)民1，劉越峰2，羅湘玉1，張軍1△，林稱意1，郭家龍1

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬十堰市太和醫(yī)院 心胸外科，湖北 十堰442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院 附屬十堰市人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

目的觀察金櫻子(Rosa Larigata Michx,RlM)對阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠模型的保護作用及相關(guān)機制。方法30只SD大鼠隨機分為空白對照組、阿霉素組模型組和金櫻子干預(yù)組（n=10）。模型組采用阿霉素（15 mg/kg）分6次隔天腹腔注射，金櫻子組按每公斤體重給予1～5g金櫻子灌胃，空白對照組僅給予等體積生理鹽水。處理結(jié)束后，觀察觀察大鼠生存率;ELISA檢測血漿腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）濃度;采用缺口末端標記法檢測心肌凋亡細胞。同時觀察心肌組織中心肌谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-PX）、過氧化氫酶（hydrogen peroxidase，CAT）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）的活力;實時定量PCR檢測銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn superoxide dismutase，CuZn-SOD）以及bcl-2、bax mRNA表達水平。結(jié)果與阿霉素組比較，金櫻子可明顯提高大鼠的生存率（P＜0.01）。阿霉素組大鼠血漿BNP濃度顯著增高（P＜0.01），金櫻子處理后BNP濃度顯著降低（P＜0.01）。此外，阿霉素組CuZn-SOD蛋白表達水平以及心肌組織GSH-PX、CAT、SOD活力明顯降低。金櫻子能提高CuZn-SOD蛋白mRNA表達水平以及心肌組織GSHPX、CAT、SOD活力。阿霉素組心肌細胞凋亡發(fā)生率顯著增高（P＜0.01）;bcl-2基因表達下降，bax基因表達增強，bcl-2/bax mRNA比值降低。高劑量金櫻子能降低阿霉素所致心肌細胞凋亡，并增強bcl-2基因表達，降低bax水平。結(jié)論金櫻子通過多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗氧化作用，并具有一定的抗凋亡效應(yīng)，其作用機制可能與影響bcl-2 和bax的表達有關(guān)。

金櫻子;阿霉素;保護作用;凋亡

心肌病是指伴有心功能障礙的心肌疾病，根據(jù)其病因的不同可分為原發(fā)性心肌病和特異性心肌病[1]。在各種因素導(dǎo)致的心肌病中，氧化應(yīng)激是心肌細胞損傷的核心環(huán)節(jié)[2]。目前通過采取有效措施保護心肌細胞，逆轉(zhuǎn)心肌重塑，是治療心力衰竭的重要方法。主要包括以利尿劑、地高辛和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑為主的“三聯(lián)療法”。此外，大劑量維生素C、維生素E以及各種免疫治療雖然取得一定療效，但最終結(jié)果仍不理想[3]。

阿霉素（adriamycin，ADR）是一種抑制RNA和DNA合成的抗腫瘤藥物，對RNA的抑制作用最強，屬周期非特異性藥物。其最顯著的副作用是可以引發(fā)藥物性心肌病而引起心力衰竭[4]，基于此特性，阿霉素被廣泛應(yīng)用于擴張型心肌病的實驗?zāi)Ｐ蚚5]。

金櫻子為薔薇科金櫻子（Rosa Laevigata Michx，RLM）的果實，研究發(fā)現(xiàn)它具有強大的抗氧化和清除自由基能力[6]。本實驗通過采用阿霉素建立心肌損傷大鼠模型，隨后用金櫻子對其進行干預(yù)，旨在觀察其對阿霉素心肌毒性的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 RNA提取試劑盒購自FUJIFILM；T-SOD試劑盒、CAT試劑盒以及GSH-PX試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。TUNEL法凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德公司。其他生化試劑主要為上海生物工程有限公司分析純產(chǎn)品。BNP ELISA檢測試劑盒購于上海復(fù)旦悅達生物技術(shù)有限公司。金櫻子購于十堰市中草藥材公司，經(jīng)去籽后用煎藥機進行熬煎（YJD 13-GL，北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責任公司），提取液濃度為2.0 g/mL。其他儀器設(shè)備：實時定量PCR儀（7500，ABI），酶標儀（iMark，BIO-RAD），石蠟切片機（RM 2235， Leica）。

1.2 心肌損傷大鼠動物模型的建立及金櫻子干預(yù) 30只SD大鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物部提供，體重（250±5）g，隨機分為3組（n=10），正常對照組：常規(guī)飼料喂養(yǎng)，并給予等體積生理鹽水灌胃；阿霉素模型組：采用阿霉素2.5 mg/kg腹腔注射，隔日注射1次，共6次。金櫻子干預(yù)組：分為低、中、高劑量組，即阿霉素處理前按每kg體重分別給予1 g、3 g、5 g金櫻子組灌胃。最后一次灌胃后，處理各組存活的大鼠，24 h后，采用1%戊巴比妥鈉0.3 mL 腹腔注射麻醉大鼠，獲取肺組織用于下一步檢測。

1.3 ELISA檢測BNP的濃度 獲取大鼠抗凝靜脈血，2500 rpm離心10min，獲取血清液儲存于－70℃以供測定BNP濃度。測定方法按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行，并用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度，根據(jù)標準曲線計算BNP的濃度。

1.4 T-SOD、GSH-PX以及CAT活性檢測 獲取大鼠心肌組織，經(jīng)0.86%生理鹽水漂洗后，置于勻漿器中研磨，按重量體積比加生理鹽水制備成10%組織勻漿，4℃下14，000 r/min離心

10 min，取上清用于T-SOD、GSH-PX以及CAT活性檢測，具體操作步驟按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行。

1.5 實時定量PCR檢測CuZn-SOD、bax和bcl-2基因

mRNA的表達 根據(jù)FUJIFILM公司提供的試劑盒操作要求獲取總RNA。利用oligo(dT)引物及SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用RNA酶處理產(chǎn)物。設(shè)計特異性引物用于CuZn-SOD、bcl-2和bax mRNA的擴增。同時采用β-actin為內(nèi)參，計算兩者比值，數(shù)據(jù)以相對含量比值表示。

1.6 采用缺口末端標記法（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡摘取心臟標本后用4%的多聚甲醛固定24 h常規(guī)石蠟包埋，切片脫蠟入水后用蛋白酶K（20μg/mL）消化15 min；1%H2O2甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加入20μLTUNEL混合液，37℃孵育1 h，TBS液漂洗、封閉；加入生物素標記抗地高辛抗體50μL， 37℃孵育30 min，TBS漂洗；DAB顯色，蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片后，鏡下觀察。隨機挑選5個不同的視野，計算凋亡指數(shù)（凋亡陽性細胞核數(shù)/總計數(shù)的細胞核）×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有分組均設(shè)立3個平行對照，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生存情況 對照組大鼠全部存活，存活率100%。阿霉素模型組建模當日大鼠無明顯變化，隨后逐日精神萎靡，食欲不振，毛色灰暗且質(zhì)地粗糙。大鼠活動顯著減少，第5 d開始有大鼠死亡發(fā)生，12 d后大鼠存活率僅70%。而采用金櫻子處理后大鼠的活動度、飲食以及毛色均較好，且無大鼠死亡。

2.2 BNP測定 各組大鼠血清中BNP含量見圖1所示。阿霉素組BNP明顯升高，而經(jīng)不同濃度金櫻子處理后，BNP逐漸降低。當金櫻子濃度達5 g/kg時，BNP含量接近對照組（79.62±11.26）ng/mL水平。

圖1 金櫻子對大鼠體內(nèi)BNP的影響1.空白對照組；2.阿霉素組；3.阿霉素+金櫻子低劑量組(1g)；4.阿霉素+金櫻子中劑量組(3g)；5.阿霉素+金櫻子高劑量組(5g)#P＜0.01，與對照組相比；*P＜0.05，與阿霉素組相比Fig.1 Effect of Rosa laevigata Michx on BNP secretion1.Control；2.Adriamycin；3.Adriamycin+Rosa laevigata Michx（1 g）；4.Adriamycin+Rosa laevigata Michx（3g）；5.Adriamycin+Rosa laevigata Michx（5 g）#P＜0.01，compared with control group；*P＜0.05，compared with Adriamycin group

2.3 各組大鼠心肌組織中CuZn-SOD mRNA的表達 定量PCR結(jié)果顯示：正常對照組CuZn-SOD mRNA表達表達較高，阿霉素作用后，CuZn-SOD mRNA水平顯著減少。而不同濃度金櫻子能上調(diào)心肌組織中CuZn-SOD的表達水平（見圖2）。

1.空白對照組；2.阿霉素組；3.阿霉素+金櫻子低劑量組(1g)；4.阿霉素+金櫻子中劑量組(3g)；5.阿霉素+金櫻子高劑量組(5g)#P＜0.01，與對照組相比；*P＜0.05，與阿霉素組相比圖2 金櫻子對大鼠心肌組織中CuZn-SOD mRNA的影響1.Control；2.Adriamycin；3.Adriamycin+Rosa laevigata Michx （1g）；4.Adriamycin+ Rosa laevigata Michx （3 g）；5.Adriamycin+Rosa laevigata Michx（5 g）#P＜0.01，compared with control group；*P＜0.05，compared with driamycin groupFig.2 Effect of Rosa laevigata Michx on CuZn-SOD mRNA expression in rat myocardium

2.4 大鼠心肌組織中T-SOD、GSH-PX和CAT的活力與正常對照組相比，阿霉素模型組心肌組織中T-SOD、GSHPX及CAT活力明顯降低（P＜0.05）。大鼠經(jīng)金櫻子治療后，心肌組織中T-SOD、GSH-PX及CAT活力明顯增高，與阿霉素組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.5 金櫻子對心肌細胞凋亡率的影響 正常大鼠心肌細胞凋亡發(fā)生率很低。腹腔注射阿霉素后，心肌細胞凋亡明顯增加，約為28%，不同濃度金櫻子干預(yù)后，心肌細胞凋亡率隨著金櫻子濃度的增高而降低。當用5 g/kg金櫻子處理后，凋亡率降至7.52%（見圖3）。

表1 大鼠心肌組織中T-SOD、GSH-PX和CAT的活力（U/mg protein）Tab.1 The enzymic activity of T-SOD, GSH-PX and CAT（U/mg protein)

圖3 金櫻子對大鼠心肌細胞凋亡的影響1.空白對照組；2.阿霉素組；3.阿霉素+金櫻子低劑量組(1 g)；4.阿霉素+金櫻子中劑量組(3 g)；5.阿霉素+金櫻子高劑量組(5 g)#P＜0.01，與對照組相比；*P＜0.05，與阿霉素組相比Fig.3 Effect of Rosa laevigata Michx on myocardial cells apoptosis1.Control；2.Adriamycin；3.Adriamycin+Rosa laevigata Michx（1 g）；4.Adriamycin+ Rosa laevigata Michx（3g）；5.Adriamycin+Rosa laevigata Michx（5 g）#P＜0.01，compared with control group；*P＜0.05，compared with Adriamycin group

2.6 凋亡基因表達 阿霉素模型組與正常組相比，bcl-2表達減少，bax的表達增加，bcl-2/bax mRNA比值減小。用金櫻子干預(yù)治療后，bcl-2的mRNA的相對表達量明顯高于阿霉素組，bcl-2/bax mRNA比值增大（見表2）。

表2 大鼠心肌組織中凋亡基因表達（相對含量）Tab.2 Apoptosis genes expression in rat myocardium（relative content）

3 討論

阿霉素屬蒽醌類抗生素，其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)有利于氧自由基的產(chǎn)生。當其進入心肌細胞后，產(chǎn)生大量O2-、H2O2或反應(yīng)性極強的HO-。這些氧自由基可作用于心肌細胞的不同細胞器及核酸，引起脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，導(dǎo)致膜完整性的破壞而引起心肌損傷[7]。大量實驗證明，阿霉素可誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生[8]。在本研究中，給SD大鼠注射15 mg/kg阿霉素24 h后，心肌組織中GSH-PX活性以及總SOD和CAT的活性明顯降低。抗氧化酶活性的降低意味著自由基清除功能減弱，表明了氧化應(yīng)激在阿霉素誘導(dǎo)心肌細胞中的作用。SOD通常以銅和鋅、或錳、鐵、或鎳作為輔因子。基本上所有的真核細胞的細胞內(nèi)都含有帶有銅和鋅的SOD，即CuZn-SOD，本研究顯示阿霉素也能抑制CuZn-SOD的表達，與國外研究結(jié)果相符[9]，說明CuZn-SOD在心肌毒性過程中有著重要作用。

BNP主要在心室合成，是反映心室功能的敏感且可靠的指標[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血漿BNP濃度顯著增加，說明阿霉素引起了心肌細胞氧化損傷，導(dǎo)致心肌細胞功能障礙，從而誘導(dǎo)心室細胞合成BNP。不同劑量的金櫻子對阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠有明顯的保護作用，不但可改善實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠的存活率，BNP濃度也接近正常組。

阿霉素導(dǎo)致心肌細胞凋亡是其心臟毒性的最終結(jié)果。抗凋亡蛋白bcl-2主要分布于線粒體膜上，其功能主要是維持線粒體的正常功能。生理條件下bax存在于胞質(zhì)中，處于非激活狀態(tài)。在各種促凋亡因子的誘導(dǎo)下，bax發(fā)生構(gòu)象改變，隨后轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，誘導(dǎo)線粒體中細胞色素C的釋放而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[11-12]。本實驗中，15 mg/kg的阿霉素處理大鼠后，bcl-2表達水平明顯下降，而bax水平則明顯增高，兩者比值降低。而金櫻子有明顯的對抗阿霉素引起的促凋亡作用。即金櫻子通過下調(diào)促凋亡基因bax上調(diào)bcl-2的表達，從而增加bcl-2/bax的比值，抑制了阿霉素所致的心肌細胞凋亡，減輕了心肌損傷，改善了心臟功能。最近研究發(fā)現(xiàn)NO可以通過抑制caspase-3的活性或抑制線粒體跨膜電勢抑制凋亡[13-14]。Amlodipine促進內(nèi)源性NO的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)[15]，金櫻子是否也在此環(huán)節(jié)發(fā)揮抗凋亡作用需進一步研究。

[1] Shankar PB,Shanthi C,Cherian KM.Pre-excitation induced left ventricular dysfunction：A less known cause of cardiomyopathy in children.Ann Pediatr Cardiol,2013,6(1)：77-79.

[2] Yang F,Chen H,Liu Y,et al.Doxorubicin caused apoptosis of mesenchymal stem cells via p 38,JNK and p 53 pathway.Cell Physiol Biochem,2013,32(4)：1072-1082.

[3] Kandala J,Upadhyay GA,Pokushalov E,et al.Meta-analysis of stem cell therapy in chronic ischemic cardiomyopathy,2013,112(2)：217-225.

[4] da Silva MG,Mattos E,Camacho-Pereira J,et al.Cardiac systolic dysfunction in doxorubicin-challenged rats is associated with upregulation of MuRF 2 and MuRF 3 E 3 ligases.Exp Clin Cardiol,2012,17(3)：101-109.

[5] Chen ZC,Chen LJ,Cheng JT.Doxorubicin-Induced Cardiac Toxicity Is Mediated by Lowering of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor delta Expression in Rats.PPAR Res,2013(2013)：456042.

[6] Jia Y,Ji L,Zhang S,et al.Total flavonoids from Rosa Laevigata Michx fruit attenuates hydrogen peroxide induced injury in human umbilical vein endothelial cells.Food Chem Toxicol,2012,50(9)：3133-3141.

[7] Zhang YW,Shi JJ,Li YJ,et al.Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity.Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2009(57)：435-445.

[8] Chularojmontri L,Ihara Y,Muroi E,et al.Cytoprotective role of Phyllanthus urinaria L.and glutathione-S transferase Pi in doxorubicin-induced toxicity in H9 c 2 cells.J Med Assoc Thai,2009,92(Suppl 3)：S 43-51.

[9] Li T,Danelisen L,Singal PK.Early changes in myocardial antioxidant enzymes inrats treated with adriamycin.Mol Cell Biochem,2002（232）:19-26.

[10] Hongkan W,Soongswang J,Veerakul G,et al.N-terminal pro brain natriuretic peptide and cardiac function in doxorubicin administered pediatric patients[J].J Med Assoc Thai,2009,92（11）：1450-1457.

[11] Tacar O,Sriamornsak P,Dass CR.Doxorubicin:an update on anticancer molecular action,toxicity and novel drug delivery systems[J].J Pharm Pharmacol,2013,65（2）：157-170.

[12] Wu S,Ko YS,Teng MS,et al.Adriamycin-induced cardiomyocyte and endothelial cell apoptosis:in vitro and in vivo studies[J].J Mol Cell Cardiol,2002,34（12）：1595-1607.

[13] Kim YM,Talanian RV,Billiar TR.Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms[J].J Biol Chem,1997（272）:31138-31148.

[14] Childs AC,Phaneuf SL,Dirks AJ,et al.Doxorubicin treatment in vivo causes cytochrome C release and cardiomyocyte apoptosis,as well as increased mitochondrial efficiency,superoxide dismutase activity,and Bcl-2:Bax ratio[J]. Cancer Res,2002（62）:4592-4598.

[15] Zhang X,Hintze TH.Amlodipine releases nitric oxide from canine coronary microvessels:an unexpected mechanism of action of a calcium channel-blocking agent[J].Circulation,1998（97）:576-580.

Protective effect and mechanism of Rosa laevigata Michx on adriamycin -induced cardiotoxicity

LUO Wei-min1, LIU Yue-feng2, LUO Xiang-yu1, ZHANG Jun1△, LIN Cheng-yi1, GUO Jia-long1
(1. Department of Cardiothoracic Surgery, Hubei University of Medicine affiliated Taihe hospital of Shiyan, Shiyan 442000, China; 2. Department of Ophthalmology，Hubei University of Medicine Affiliated People’s Hospital of Shiyan, Shiyan 442000, China）

ObjectiveTo study the protective effect mechanism of Rosa laevigata Michx (RLM) on cardiotoxicity induced by adriamycin in rats。Method30 SD rats were randomly into control group, doxorubicin group and RLM groups. The control group was injected with normal saline injection, while the model group was injected with adriamycin intraperitoneally at the dosage of 15 mg/kg every other day. For the RLM groups，1～5 g/kg RLM were given after adriamycin injection. The survival rate, plasma BNP was observed. Apoptosis of cardiomyocyte was detected by instituted-labeled DNA (TUNEL). The activity of GSH-PX, CAT and total SOD in the myocardium tissue were also observed. The expression level of CuZn-SOD , bcl-2 and bax were detected by real-time PCR。ResultsThe survival rate was signi fi cantly improved in SD rats treated with RLM compared with that in the adriamycin group (P＜0.01). The BNP level was increased when treated by adriamycin (P＜0.01), and decreased after RLM administration (P＜0.01). RLM could also upregulate the expression of the CuZn-SOD mRNA level, and enhance the activity of GSH-PX, CAT and T-SOD compared with that in adriamycin group. Adriamycin could induce myocardial cells apoptosis, as demonstrated by TUNEL. RLM could inhibit adriamycin-induced apoptosis, bax mRNA expression, and increase bcl-2 expression and bcl-2/bax ratio。ConclusionRLM exhibit some antioxidant activity through many stages, and the antiapoptosis activity may be related to affect the expression of bax and bcl-2 expression.

rosa laevigata Michx; adriamycin; protective effect; apoptosis

R 453.9

A

1005-1678(2014)01-0029-04

十堰市科技公關(guān)項目（2009S48）

羅衛(wèi)民，碩士，主治醫(yī)師；張軍，通信作者，Email:zhjun 159@ sina.com。