于丹，劉巖，趙雪，程金章，齊欣萌，金春順

（吉林大學 第二臨床醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春 130041）

鋅指轉錄因子Snail在喉癌中的表達及其與不同亞群喉癌細胞侵襲和轉移的相關性研究

于丹，劉巖，趙雪，程金章，齊欣萌，金春順△

（吉林大學 第二臨床醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春 130041）

目的探討鋅指轉錄因子Snail在喉鱗狀細胞癌中的表達情況及其與臨床特征的關系,通過檢測不同喉癌細胞亞群中Snail的表達研究其與喉癌侵襲轉移的相關性。方法免疫組化法檢測吉林大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科48例喉癌組織和20例癌旁對照組織手術標本Snail蛋白的表達情況，并分析Snail與臨床特征的相關性。采用RT-PCR及Western blot和細胞免疫化學染色檢測CD 44+CD 133+、CD 44-和CD 133-不同亞群喉癌細胞中Snail和粘附分子E-cadherin的表達情況，并與侵襲及轉移進行相關性探討。結果Snail在喉癌組織中表達水平顯著高于癌旁對照組織(P＜0.01)。Snail的表達與喉癌的臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度密切相關（P＜0.05），而與患者的性別、年齡、臨床分型等無關。RT-PCR及Western blot檢測結果均證實，Snail在CD 44+CD 133+喉癌細胞中的表達水平明顯高于CD 44-和CD 1333-喉癌細胞，而粘附分子E-cadherin在CD 44+CD 133+喉癌細胞中的表達水平明顯低于CD 44-和CD 133-喉癌細胞，細胞免疫組化染色證實CD 44+CD 133+喉癌亞群細胞中Snail和E-cadherin的表達呈負相關。結論Snail的表達與喉癌的侵襲轉移密切相關,且在高致瘤亞群CD 44+CD 133+喉癌細胞中呈顯著高表達，與粘附分子E-cadherin的表達呈負相關，與喉癌細胞的侵襲和轉移具有密切相關性。

喉癌；Snail；E-cadherin；腫瘤轉移;上皮細胞-間質轉化

1 資料和方法

1.1 一般資料 隨機選取吉林大學第二醫(yī)院2011年1月～2013年10月48例喉鱗狀細胞癌患者癌組織和20例同期手術病例的癌旁組織進行SP染色，每例患者均有明確的臨床分型、病理診斷及詳細的病歷資料（所有患者資料的選取已經過倫理委員會批準），臨床分期采用2002年抗癌國際聯(lián)盟（UICC）正式頒布的喉癌TNM分期法?；颊咝g前均未接受放療和化療，男性33例，女性15例，年齡51～67歲，平均59.21±2.34歲。將Hep-2喉癌細胞應用帶有熒光的細胞表面抗原CD 133和CD 44標記，應用流式細胞分選技術分選為CD 133+CD 44+細胞組、CD 44-細胞和CD 133-細胞組。

1.2 實驗試劑及用品 SP免疫組化試劑盒購自長春百奧生物技術公司。Snail、E-cadherin和GAPDH引物均由上海生工生物技術有限公司合成。Snail和E-cadherin單克隆抗體購自SantaCruz公司。RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司。藻紅蛋白（phycoerythrobilin，PE）抗鼠CD 133及異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)抗鼠CD 44購自美國 Gene Tex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化SP法 具體方法詳見試劑盒說明書。結果判定：Snail陽性信號為細胞核及細胞質內棕黃色顆粒，每張切片高倍鏡下隨機選取10不同的視野，按陽性細胞數占視野中總細胞數的百分比計分。陽性細胞率＜10%為1分，10%＜陽性細胞率≤50%為2分，50%＜陽性細胞率≤75%為3分，陽性細胞率＞75%為4分；同時，根據染色的強弱程度計分：陰性1分，弱染色2 分，中等強度染色3分，強染色4分。通過二者的乘積來判斷結果：≤4分為（－）；5～8分為（＋）；9～12分為（＋＋）；13～16 分為（＋＋＋）。

1.3.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（P T-P C R）和Western blot法檢測Snail和E-cadherin基因在各亞群喉癌細胞中的表達：針對人 Snail基因的 cDNA序列(5’-AGAGTTTACCTTCCAGCCCCTACGACCAG GCCC-3’；5’-AAGGCCTTCAACTGCAAATACTG CAA-3’）片斷長度為315 bp。針對人E-cadherin基因cDNA序列（5’-GGCATTGGGAAGAATCAGCC-3’；5’－ATTGATGTGTCCAATGGCCG-3’）片段長度：4 8 7 b p。以 GA P D H為內參基因，其上游引物序列為5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物序列為 5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，片斷長度為600 bp。PCR擴增條件為熱變性94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，30～35個循環(huán)，72℃4 min。取5μL反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。Westernblot法常規(guī)提取蛋白，Bradford法進行蛋白定量。蛋白電泳，電轉膜后用0.01 mol/L的 PBS洗膜3次，8%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（1∶1000），4℃過夜，洗膜3次，加入二抗（1∶1000），37℃孵育1 h，洗膜3次，按化學發(fā)光（ECL）試劑盒說明操作，顯影、定影、沖洗、晾干后進行灰度掃描。

1.3.3 細胞培養(yǎng)及流式細胞儀分選：應用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基常規(guī)行Hep-2喉癌細胞培養(yǎng)，各個喉癌細胞亞群的流式細胞儀分選步驟詳見參考文獻[4]。

1.3.4 免疫細胞化學染色 將流式細胞儀分選得到的CD 44+CD 133+細胞常規(guī)培養(yǎng)并以1×104/孔密度接種于24孔板內的蓋玻片上，待細胞生長至80%融合后，PBS沖洗蓋玻片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次后經3%過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗3次后10%正常山羊血清室溫封閉20 min，滴加一抗（1∶50鼠抗人Snail抗體和1∶100鼠抗人E-cadherin抗體）。4℃過夜后，按SP免疫組化染色試劑盒說明操作，DAB染色，蘇木精復染，棕褐色為陽性顯色。

1.4 統(tǒng)計學方法 各組正態(tài)計量資料均采用“x±s”表示，KS 400圖像系統(tǒng)進行灰度分析，用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。所得數據百分率的比較用χ2檢驗。檢驗水準α＝0.05。采用單因素方差分析及各組間比較。

2 結果

2.1 免疫組化分析Snail蛋白在喉癌組織中的表達 免疫組化染色結果：Snail蛋白在癌旁對照組織中染色呈陰性或弱陽性，Snail蛋白陽性表達主要集中在癌細胞核及細胞質內，鏡下呈現(xiàn)棕黃色或者棕色顆粒。在高分化喉癌組織中表現(xiàn)為弱染色和或中等強度染色，在中低分化喉癌組織中，多表現(xiàn)為強染色(見圖1)。

圖1 免疫組化檢測喉癌組織中Snail的表達1 a 癌旁組織中表達較少（×200）；1 b.高分化喉癌組織中為弱染色（×200）；1 c.中分化鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)較強染色（×200）；1 d.低分化鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)強染色（×200）Fig.1 Analysis of Snail protein expression by immunohistochemistry in laryngeal carcinomas1 a Negative Snail staining in adjacent non-cancerous epithelial tissue sample (×200)；1 b.weak positive Snail staining in well differentiated laryngeal carcinoma (×200)；1 c.Positive Snail staining in moderately differentiated laryngeal carcinoma (×200)；1 d.Strong Positive Snail staining in poorly differentiated laryngeal carcinoma (×200)

2.2 Snail因子在喉鱗狀細胞癌中的表達與臨床特征的相關性 Snail的表達與喉癌的臨床特征的相關性見表1所示。

表1 Snail蛋白的表達與喉鱗狀細胞癌臨床特征的相關性Tab.1 The correlation between the Snail expression and clinical characteristics of laryngeal carcinoma

2.3 Snail和E-cadherin在各亞群喉癌細胞中的表達情況 RT-PCR及Western blot檢測結果均證實，各亞群喉癌細胞中Snail和E-cadherin mRNA和蛋白質水平均有不同程度的表達（見圖2及表2），Snail在CD 44+CD 133+喉癌細胞中的表達水平明顯高于CD 44-和CD 1333-喉癌細胞，而粘附分子E-cadherin在CD 44+CD 133+喉癌細胞中的表達水平明顯低于CD 44-和CD 133-喉癌細胞組（圖2 a和圖2 b），且差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各亞群細胞中Snail 和E-cadherin mRNA灰度值及蛋白表達量Tab 2. The expression of mRNA and protein of Snail and E-cadherinin in subgroups of laryngeal carcinoma cells

以GAPDH蛋白表達量為對照（設為1.000），在上樣蛋白量基本一致的條件下，各亞群細胞中Snail和E-cadherin蛋白均有不同程度的表達。

2.4 細胞免疫化學染色檢測CD 44+CD 133+喉癌細胞亞群中Snail和E-cadherin的表達情況 CD 44+CD 133+喉癌細胞亞群中Snail呈現(xiàn)高表達，胞漿和胞核被染成深淺不一的棕黃色；而E-cadherin呈弱陽性表達（見圖3）。

圖2 a 各亞群喉癌細胞中Snail 和E-cadherin mRNA的表達M.1 kb DNA Ladder；1.CD 44-喉癌細胞中Snail 和E-cadherin的表達；2.CD 133-喉癌細胞中Snail和E-cadherin 的表達；3.CD 44+CD 133+喉癌細胞中Snail和E-cadherin的表達Fig.2 a Snail and E-cadherin mRNA expression in different subgroup laryngeal carcinoma cellsM.1 kb DNA ladder；1.Snail and E-cadherin mRNA expression in CD 44- laryngeal carcinoma cells；2.Snail and E-cadherin mRNA expression in CD 133-laryngeal carcinoma cells；3.Snail and E-cadherin mRNA expression in CD 44+CD 133+laryngeal carcinoma cells

圖2 b 各亞群喉癌細胞中Snail和E-cadherin蛋白的表達1.CD 44+CD 133+喉癌細胞中Snail和E-cadherin 蛋白質的表達；2.CD 44-喉癌細胞中Snail和E-cadherin的表達；3.CD 133-喉癌細胞中Snail和E-cadherin的表達Fig.2 b The expression of Snail and E-cadherin protein in different subgroup laryngeal carcinoma cells1.The expression of Snail and E-cadherin protein CD 44+ CD 133+inlaryngeal carcinoma cells；2.Snail and E-cadherin mRNA expression in CD 44- laryngeal carcinoma cells；3.Snail and E-cadherin mRNA expression in CD 133- laryngeal carcinoma cells

圖3 CD 44+CD 133+喉癌細胞亞群中Snail和E-cadherin的表達情況3 a. Snail在胞核及胞質可見高表達，表現(xiàn)為棕黃色顆粒（×200）；3 b.E-cadherin表達在細胞膜，呈弱陽性表達（×200）；3 c.CD 44+CD 133+喉癌細胞陰性對照（×200）Fig.3 The expression of Snail and E-cadhein in CD 44+CD 133+ of laryngeal carcinoma cells3 a. Strong Positive Snail staining in cytoplasm and cell nucleus of CD 44+CD 133+ laryngeal carcinoma cells(×200)；3 b.weak positive E-cadherin staining on the surface of cell membrane in CD 44+CD 133+ laryngeal carcinoma cells (×200)；3 c.negtive control of CD 44+CD 133+ laryngeal carcinoma cells (×200)

3 討論

喉癌是東北地區(qū)患病率較高的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%[5]，其發(fā)病率居頭頸部腫瘤第三位。隨著臨床醫(yī)學的不斷發(fā)展，喉癌的綜合治療方式（包括手術及放、化療方案）得到不斷改進，但局部復發(fā)和淋巴結轉移仍是喉癌患者主要的死亡原因。因此，研究喉癌的轉移機制并尋找新的治療靶點是我們迫切需要解決的問題 。目前，“腫瘤干細胞”學說認為：腫瘤細胞具有異質性，具有腫瘤干細胞特性的細胞亞群有較強的侵襲和轉移能力[6]，是腫瘤復發(fā)和轉移的根源所在，而EMT是腫瘤干細胞侵襲、轉移早期的重要啟動步驟。EMT過程中首先是與細胞粘附有關的細胞因子的表達下調使連續(xù)的上皮層細胞間作用變松散，從原發(fā)部位脫落，其次是上皮細胞分子構成改變，使細胞獲得侵襲和運動能力。在此過程中，E-cadherin下調起到了關鍵作用。細胞黏附分子E-cadherin蛋白是一種鈣依賴性細胞黏附分子[7]，分布在上皮組織中，而鋅指轉錄因子Snail則通過與E-cadherin上游啟動子區(qū)結合而轉錄抑制其表達［8］。人們首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)了鋅指轉錄因子Snail的存在，在原腸胚形成中，可以通過轉錄抑制E-cadherin表達，促進細胞從相鄰細胞脫落并遷移至遠處［9－10］。由于在腫瘤轉移中也存在癌細胞脫落、轉移的事件發(fā)生，因此引起了廣大腫瘤研究者對Snail/ E-cadherin通路在腫瘤轉移中作用的研究興趣。研究證實[11]：通過RT-PCR檢測Snail的表達，證實在伴有淋巴結轉移的乳腺癌組織中，Snail的表達明顯增高，E-cadherin表達下降，二者呈負相關。卓文磊等[12]發(fā)現(xiàn)：高侵襲性人肺腺癌A 549細胞株高表達Snail，而E-cadherin呈低表達，提示Snail/E-cadherin通路與腫瘤侵襲和轉移相關。研究證明在肝癌細胞中，Snail不僅通過抑制E-cadherin的表達來介導EMT的發(fā)生，還通過調控基質金屬蛋白酶家族成員的表達來增加肝癌細胞的侵襲能力，在肝癌細胞的侵襲和轉移中起重要作用[13]。夏曦等[14]研究表明：將PEGFPC 1/Snail轉染入卵巢癌細胞株A 2780后，細胞內E-cadherin的表達明顯下調，而轉染Snail/siRNA入卵巢癌細胞株，則使E-cadherin表達明顯上調，提示Snail因子的表達與卵巢癌細胞轉移具有相關性。

在本項研究中，首先采用免疫組化SP方法檢測喉癌組織中Snail的表達，并觀察與喉癌臨床病理參數之間的關系。結果表明：隨著喉癌病理分級的增高，Snail的陽性表達強度隨之增強，提示惡性程度較高的喉癌細胞更具有轉移能力。Snail的表達與患者的年齡、性別及腫瘤的臨床分型無相關性。而與淋巴結轉移和臨床分期具有相關性，在伴有淋巴結轉移的喉癌組織中表達明顯高于不伴有淋巴結轉移者，提示Snail基因與喉癌細胞的淋巴結轉移具有相關性，可以成為進一步研究的靶點。

研究表明：Snail和 E-cadherin在很多上皮性癌中存在明顯的反向表達。在對鱗狀細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，E-cadherin陰性克隆細胞侵襲力強且高表達Snail因子，E-cadherin陽性克隆侵襲力弱，Snail的表達呈陰性或弱陽性[15]。本課題組在前期針對喉癌干細胞的初步研究中已經證實高致瘤細胞亞群（CD 44+CD 133+細胞）具有較強的局部侵襲能力[4]，因此預通過此研究證實其侵襲能力是否與Snail 的表達具有相關性。應用RT-PCR、Western blot和細胞免疫化學染色，結果均證實在基因和蛋白質水平上Snail 在高致瘤亞群CD 44+CD 133+喉癌細胞中呈現(xiàn)高表達，且與E-cadherin表達呈負相關，筆者認為，Snail可能通過抑制E-cadherin的表達從而導致上皮間連接的破壞，使癌細胞間粘附松散則易于脫離原發(fā)灶而發(fā)生侵襲和遠處轉移。因此聯(lián)合檢測Snail與E-cadherin的表達可作為喉癌惡性程度及預后的參考指標。

腫瘤細胞的侵襲轉移過程受多種因素的影響，而EMT參與腫瘤侵襲轉移的復雜的調控機制，本實驗證實了Snail的表達與喉癌臨床分期及淋巴結轉移具有相關性，同時亦初步證實了在具有較強的侵襲能力的喉癌細胞CD 44+CD 133+亞群細胞中Snail/E-cadherin通路可能在其中起到了重要的作用，相關的機制還有待于在進一步的實驗中深入的研究和探討。

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Expression of Snail in laryngeal carcinoma and its relationship with invasion and metastasis in subgroup laryngeal carcinoma cells

YU Dan, LIU Yan，ZHAO Xue，CHENG Jin-zhang，QI Xin-meng，JIN Chun-shun△
(Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Second Hospital of Jilin University , Changchun 130041,China)

ObjectiveTo study the expression of Snail in laryngeal carcinoma and to explore its relationship with invasion and metastasis in subgroup laryngeal carcinoma cells。MethodThe expression of Snail protein was examined by immunohistochemistry staining in the tissue of laryngeal carcinoma. The statistical evaluation was performed to detect the correlation between the Snail protein expression and clinical features. In different subgroups of laryngeal carcinoma cells (CD 44+CD 133+cells, CD 44 and CD 133–cells), the expression of Snail and adhesion molecules E-cadherin were detected by RT-PCR，Western blot test and immunochemical staining which were studied in the correlation with invasion and metastasis。ResultsThe result of immunohistochemical staining revealed that Snail was moderately or highly expressed in the tissue of laryngeal carcinoma significantly and higher than those in adjacent non-cancerous tissues(P＜0.01). Expression of Snail was highly correlated with lymph node metastasis, tumor differentiation and clinical classi fi cation（P＜0.05）.However, it was not related to the age , gender and clinical type. RT-PCR and Western blot test results con fi rmed that the expression level of Snail was signi fi cantly higher in CD 44+CD 133+laryngeal cancer cells than in CD 44-and CD 133-laryngeal cancer cells, otherwise the expression level of E-cadherin in CD 44+CD 133+laryngeal cancer cells was signi fi cantly lower than in the CD 44-and CD 133-laryngeal cancer cells. Cell immunohistochemical staining con fi rmed the expression of Snail and E-cadherin were negatively correlated in CD 44+CD 133+laryngeal cancer cells。ConclusionOver expression of Snail in laryngeal carcinoma is closely related to the development of laryngeal cancer and lymph node metastasis. The expression of Snail in the CD 44+CD 133+laryngeal cancer cell subgroup is negatively correlated with adhesion molecules E-cadherin, which is a close correlation with invasion and metastasis of laryngeal cancer cells.

laryngeal carcinoma；Snail；E-cadherin；tumor metastasis; epithelial-mesenchymal transition

R 739.91

A

1005-1678(2014)01-0001-05

上皮細胞-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在特定的生理及病理情況下向間充質細胞轉化的現(xiàn)象，表現(xiàn)為上皮細胞失去極性，與周圍細胞和基質間的黏附能力減小，遷移性和運動能力增強，EMT是腫瘤細胞侵襲、轉移早期的重要啟動步驟，與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移有著密切的關系［1］。研究表明：轉錄因子Snail可促進EMT的發(fā)生，并在多種腫瘤中呈高表達［2］。近年來Snail/E-cadherin信號通路在EMT中的作用越來越受到人們的關注[3]。本研究通過檢測轉錄因子Snail在喉鱗狀細胞癌中的表達，研究其與喉癌臨床特征的關系，并通過檢測不同生物學特性喉癌細胞亞群中Snail和E-cadherin的表達情況，評估其與喉癌細胞的侵襲和轉移的關系。

吉林省自然科學基金項目（20130101151JC）；教育部博士點新教師基金項目（20120061120092）

于丹，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：喉癌干細胞的基礎研究，E-mail:yudan 19792003@163.com；金春順，通信作者，女，教授，博士生導師，研究方向：頭頸腫瘤的基礎及臨床研究，Tel:0431-88796636，E-mail:chunshunjindan@163.com。