孫盛梅，KOUN Linka，張丹鳳，趙巖巖，Rajina SHRESTHA

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江佳木斯154003)

子宮內(nèi)膜異位癥是最常見的良性婦科疾病之一，它可能會影響10%育齡婦女。子宮內(nèi)膜異位癥的典型癥狀是疼痛和不孕。子宮內(nèi)膜異位癥的特點(diǎn)表現(xiàn)是由子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮腔以外的異位。病變通常位于腹膜，在卵巢或浸潤進(jìn)入腹腔內(nèi)的器官［1］。有幾種理論對子宮內(nèi)膜異位癥的病因，已被認(rèn)為腹膜，直腸陰道深部，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，并稱為子宮內(nèi)膜異位，有所不同來源［2］。

雖然陰道超聲檢查是有價值的，特別是在女性卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，子宮內(nèi)膜異位癥的診斷通常需要腹腔鏡確診。超聲不是腹膜植入物和粘連的診斷或疾病分期的有用工具。此外，腫瘤性卵巢囊腫與子宮內(nèi)膜異位囊腫在超聲表達(dá)相似，因此，需要在診斷慎重考慮。此外，子宮內(nèi)膜異位癥是增加發(fā)生卵巢癌的某些亞型的風(fēng)險，如子宮內(nèi)膜樣和透明細(xì)胞癌［3］。有數(shù)據(jù)表明，40%的子宮內(nèi)膜樣卵巢癌和50%的透明細(xì)胞性卵巢癌的是與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)聯(lián)［4］。子宮內(nèi)膜樣卵巢癌和透明細(xì)胞癌被認(rèn)為是出現(xiàn)，至少部分來自子宮內(nèi)膜異位癥。類似的病理生理機(jī)制可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展，以及在其轉(zhuǎn)變?yōu)槁殉擦鰳硬∽儯?］。

目前，CA125是在卵巢癌診斷中最常用的生化標(biāo)志物。然而，它涉及較高的假陽性率在良性婦科疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥［6］。此外，CA125在識別早期卵巢癌具有非常低的敏感性［7］。因此，為了提高卵巢癌診斷的特異性和敏感性，采用新的生物標(biāo)志物，如HE4(人附睪分泌蛋白E4；WAP四二硫化物核心域蛋白2，WFDC2)單獨(dú)或與CA125的組合已被廣泛研究［8，9］。

除了卵巢癌的診斷，CA125可用于評估治療子宮內(nèi)膜異位癥的效力以及子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)。然而，由于缺乏敏感性和特異性已經(jīng)顯著阻礙生物標(biāo)記物作為診斷測試［10，11］。另一方面，標(biāo)志物包括CA125已經(jīng)被建議提出來預(yù)測子宮內(nèi)膜異位癥的患者的一個子集存在［12］。

人類附睪分泌蛋白E4是一種新的血清學(xué)標(biāo)志物用于卵巢癌的診斷。與以前使用的標(biāo)記物相比，它具有更高的敏感性用于檢測卵巢癌，特別是Ⅰ期［9，13］，而 HE4 編碼基因WFDC2表達(dá)是特別在漿液性和子宮內(nèi)膜樣卵巢癌［14，15］。然而，研究證明它還表示在其他一些類型的腫瘤，例如肺腺癌［15］。其表達(dá)也很明顯在正常子宮內(nèi)膜腺體和子宮內(nèi)膜癌［14，15］，但在子宮內(nèi)膜異位病灶包括卵巢子宮內(nèi)膜異位表達(dá)是不知道。

在本研究中，我們測量血清HE4和CA125濃度在129例內(nèi)膜異位癥患者其中70個有卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫。獲得的結(jié)果的數(shù)據(jù)與17例子宮內(nèi)膜癌患者，15例卵巢癌和67例健康對照患者進(jìn)行比較。mRNA表達(dá)的編碼基因HE4和CA125，即WFDC2和MUC16，分別在不同類型的子宮內(nèi)膜異位、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜的組織標(biāo)本進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011-12～2013-10的住院患者被納入研究。采樣前所有病人的書面知情同意已同意，并符合研究方案經(jīng)倫理。

婦女的血清樣本確診為子宮內(nèi)膜異位癥(Endo，n=130)，卵巢癌(OvCa，n=15)，或子宮內(nèi)膜癌(EmCa，n=17)被納入研究，以及健康對照67個樣本(CTRL)。卵巢子宮內(nèi)膜異位患者的血清樣品(OvEndo中，n=70，ASRM臨床分期3～4)被評價為在分析中一個單獨(dú)的組。該疾病是在腹腔鏡或剖腹探查確診，并通過組織病理學(xué)評估證實(shí)。本研究患者的描述列于表1。子宮內(nèi)膜異位癥患者根據(jù)美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(ASRM)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了分期1～4期。卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌患者根據(jù)FIGO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了分期［16］。在15例卵巢癌包括8例漿液性，3例黏液性，2例透明細(xì)胞，1例子宮內(nèi)膜樣和1例小細(xì)胞癌。四例卵巢癌是I期，其余11例為晚期Ⅱ～Ⅳ期。所有子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜樣腺癌。15例子宮內(nèi)膜癌癥僅限于子宮(Ⅰ～Ⅱ期)，而2例轉(zhuǎn)移盆腔淋巴結(jié)(III期)。對照受試者(n=67)進(jìn)行了輸卵管絕育期間以確定排除子宮內(nèi)膜異位癥，子宮內(nèi)膜活檢排除子宮內(nèi)膜癌，腹腔鏡排除卵巢癌的可能。子宮內(nèi)膜異位癥，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，和健康對照的平均年齡分別是31.6，63.5，60.2和38.6歲。

表1 患者描述包含在血清HE4和CA125的分析

WFDC2和MUC16的基因表達(dá)，分別編碼HE4和CA125蛋白，被評估于148例非卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶，29例卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，16例卵巢癌和15例子宮內(nèi)膜癌，64例子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，和42例健康對照組的子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。13例卵巢癌為漿液性，一個是子宮內(nèi)膜樣癌和一個為未分化。所有子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜樣腺癌。組織樣本采集在腹腔鏡或開腹手術(shù)。子宮內(nèi)膜活檢使用無菌Pipelle采樣器收集。所有組織樣品被快速冷凍并儲存在液氮中。

1.2 血清HE4和CA125分析

收集血清樣品于進(jìn)入手術(shù)前，血清放置約非肝素化試管，保持30min后在室溫下，以3000rpm速度離心15min(800g)中。這些血清保存在-20℃或-80℃。人類附睪分泌蛋白E4和CA125的濃度，在血清樣品中通過ELISA分析(Fujirebio公司診斷公司，美國)根據(jù)制造商的指示進(jìn)行分析。

1.3 表達(dá)分析

WFDC2和MUC16的基因表達(dá)水平作為我們研究的全基因組微陣列分析的一部分?？俁NA分離用Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，其應(yīng)用 RNeasy柱(Qiagen，美國)和DNA酶(無RNA酶的DNA酶組(Qiagen公司)或DNA酶I(Invitrogen)的)進(jìn)一步純化處理。將RNA濃度測定用Nano-Drop ND-1000(賽默飛世爾科技，美國)和RNA質(zhì)量通過的Experion分析(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，美國)進(jìn)行控制。所有微陣列分析的后續(xù)步驟均在Finnish的DNA微陣列中心利用Sentrix Human Illumina 6 V2 Expression BeadChips，其中包含了超過47000個已知基因，候選基因，和剪接變種。RNA樣品(300ng每件)用作模板用于制備雙鏈cDNA，然后生物素化cRNA使用Illumina RNA全預(yù)備擴(kuò)增試劑盒(Ambion公司，美國)。將標(biāo)記的cRNA純化和雜交到BeadChip芯片在55℃下保持16h，接著全基因組基因表達(dá)。雜交是與Cyanine3-鏈霉(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)檢測和陣列進(jìn)行掃描與Illumina BeadArray閱讀器。正?；臀㈥嚵袛?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件研發(fā)套件SPSS19進(jìn)行。使用探針I(yè)LMN_1706612和ILMN_1799120為WFDC2的表達(dá)水平進(jìn)行分析；使用探針I(yè)LMN_1736316為MUC16的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Tukey多重比較，進(jìn)行了血清HE4和CA125濃度的單獨(dú)和組合的統(tǒng)計(jì)分析，以95%為明智的置信水平。HE4和CA125標(biāo)記的分類能力，單獨(dú)和共同，使用二進(jìn)制和多分類Logistic回歸模型交叉驗(yàn)證進(jìn)行了評估。在交叉驗(yàn)證反過來每個樣品，而其他被保留用于測試模型。在95%特異性的敏感性和正確的概率(診斷符合率)被交叉計(jì)算驗(yàn)證回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 血清HE4和CA125的濃度

血清HE4平均濃度相似，低于70pM的限制值對于升高［9］在子宮內(nèi)膜異位癥患者(平均46.2pM)和健康對照組(39.5pM)，而不論該疾病分類或存在的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫的分期(ASRM：Ⅰ期：46.6pM；Ⅱ期：45.9pM；Ⅲ期：43.5pM；Ⅳ期：46.6pM；OvEndo：47.0pM)。然而，在卵巢癌患者明顯增加的血清HE4濃度(1135.1pM)，子宮內(nèi)膜癌患者血清HE4濃度也顯著升高(98.3pM，P＜0.01)。HE4濃度在不同類型的卵巢癌的水平是最高的是漿液性(2022.5pM，n=8)，而在透明細(xì)胞癌也顯然升高(387.5 pM，n=2)和黏液癌也顯著升高(212.3pM，n=3)。不同患者群體血清濃度見表2。

表2 血清HE4和CA125的濃度在患者的子宮內(nèi)膜異位癥，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌

CA125血清水平在卵巢癌患者最高(平均1127.3umol/L，P＜0.01)，但也顯著(P＜0.01)升高在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者(45.3umol/L)和高級非卵巢子宮內(nèi)膜異位癥(ASRM第Ⅳ期，41.2umol/L)與健康對照組(8.7umol/L)進(jìn)行比較。這些CA125濃度也高于正常界線值(35umol/L)。濃度的增加隨著子宮內(nèi)膜異位癥的增加ASRM分期而升高，見表2。然而，子宮內(nèi)膜異位癥患者 CA125中位數(shù)濃度(33.7umol/L)是低于CA125正常界線值。子宮內(nèi)膜癌患者血清CA125水平(21.0umol/L)也顯著(P＜0.05)明顯高于健康對照組，即使偏低于正常界線值。

HE4，CA125，或它們聯(lián)合應(yīng)用兩兩比較計(jì)算95%特異性的敏感性。區(qū)分卵巢癌患者與健康對照，CA125和HE4聯(lián)合相對于CA125或HE4單獨(dú)的診斷符合率最高(96.4%)和敏感性最高(93.9%)，見表3。此外，該聯(lián)合具有最高的診斷符合率(93.8%)和敏感性(79.6%)也用于卵巢子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢癌的鑒別診斷。該聯(lián)合也區(qū)分卵巢子宮內(nèi)膜異位癥與健康對照，并幾乎盡與單獨(dú)CA125準(zhǔn)確，即使HE4單獨(dú)是一個不太好對于宮內(nèi)膜異位癥。最后，HE4和CA125的聯(lián)合具有最高的準(zhǔn)確度(82.9%)對于卵巢癌，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，和健康對照組之間的比較。

2.2 HE4和CA125編碼基因的表達(dá)

WFDC2(編碼HE4)和MUC16(編碼CA125)的組織樣品中的mRNA表達(dá)水平見表4。卵巢癌的表達(dá)與卵巢子宮內(nèi)膜異位比較，而子宮內(nèi)膜癌和非卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶的表達(dá)與健康對照組正常子宮內(nèi)膜進(jìn)行比較。WFDC2的表達(dá)顯著(P＜0.05)在卵巢癌(中位數(shù)的LOG2強(qiáng)度值9.25)比在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫(6.63)與5.8倍的變化(FC)。然而，當(dāng)與健康的子宮內(nèi)膜(7.87)相比，子宮內(nèi)膜癌(8.72)的1.9倍的高表達(dá)沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，表達(dá)數(shù)據(jù)在用在不同的病人組和對照觀察HE4差分血清濃度線。與此相反，MUC16的mRNA表達(dá)水平在各樣品相對穩(wěn)定的，而所有的比較之間的FC是0.7～1.3。

表3 腫瘤標(biāo)志物準(zhǔn)確度和敏感性在95%的特異性對于卵巢癌和卵巢子宮內(nèi)膜異位癥

表4 WFDC2(HE4)和MUC16(CA125)的mRNA表達(dá)在子宮內(nèi)膜，非卵巢和卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的組織標(biāo)本為log2強(qiáng)度值

3 討論

HE4是一種新的血清學(xué)標(biāo)志物尤其是卵巢癌診斷中使用了［8，9，17］。因?yàn)樗母呙舾行?，它也有用對于檢測 I期卵巢癌［9，13］。此外，HE4已被建議作為一種生物標(biāo)志物為子宮內(nèi)膜癌的診斷［18］。目前，幾種生物標(biāo)志物板被評估，以增加卵巢癌診斷的敏感性和特異性。CA125和HE4聯(lián)或不聯(lián)合其他生物標(biāo)志物如 Glycodelin，Plau-R，MUC-1，PAI-1［13］，SMRP［9，17］，CA72-4，和骨橋蛋白［9］進(jìn)行了評估，以改善卵巢癌的診斷。該數(shù)據(jù)表明，通過組合這些標(biāo)志物的預(yù)測準(zhǔn)確性在卵巢惡性腫瘤是比單獨(dú)應(yīng)用任何標(biāo)志物的更好。生物標(biāo)志物包括HE4的板已經(jīng)評價也用于監(jiān)測卵巢癌的復(fù)發(fā)［13，19］。

在女性組織，HE4免疫反應(yīng)已經(jīng)被證明是表達(dá)最高在生殖道，包括宮頸腺體，子宮內(nèi)膜腺體，輸卵管和前庭大腺腺上皮［14，15］。相反，正常卵巢表面上皮，其不表達(dá) HE4，由化生苗勒管上皮內(nèi)襯皮質(zhì)包涵囊腫已顯示大量表達(dá)的蛋白質(zhì)［14］。HE4蛋白在卵巢腫瘤中的表達(dá)最高的是漿液性癌，但免疫組化檢測到在絕大多數(shù)的卵巢子宮內(nèi)膜樣和透明細(xì)胞癌［14，15］。除了卵巢癌，一些肺、子宮內(nèi)膜和乳腺腺癌已經(jīng)顯示出表達(dá)HE4［15］。雖然蛋白質(zhì)已經(jīng)在正常和惡性子宮內(nèi)膜被檢測到，HE4在子宮內(nèi)膜異位病灶的表達(dá)只是表面上已知的。近日，分析HE4在166例卵巢癌與其他幾種盆腔腫塊，其中29例有子宮內(nèi)膜異位癥［9］。它們表明，HE4和CA125的聯(lián)合是其他生物標(biāo)記物中區(qū)分卵巢癌患者從那些與其他盆腔腫塊的最佳組合。然而，子宮內(nèi)膜異位病變的種類并沒有說明。

與其他最近的研究結(jié)果相一致［8，9，18，20］，我們發(fā)現(xiàn) HE4濃度升高在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的患者。本數(shù)據(jù)表明，不論HE4編碼基因在子宮內(nèi)膜異位病灶或是血清HE4濃度在子宮內(nèi)膜異位癥患者的任何類型的子宮內(nèi)膜異位癥不表達(dá)增加。而HE4甚至沒有在患者的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥增加。相反，CA125血清水平在晚期子宮內(nèi)膜異位癥和卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫增加，符合預(yù)期。應(yīng)當(dāng)指出的是子宮內(nèi)膜異位癥診斷通常是在年輕成年(25～35歲)和常在絕經(jīng)后消失，而卵巢癌的發(fā)生率增加于老年婦女(在50～60歲的年齡發(fā)病率最高)。有趣的是，已經(jīng)報道，HE4的濃度隨著年齡的增大在健康的絕經(jīng)后婦女，而CA125不是［21］。因此，同時測量HE4和CA125，而不是單獨(dú)的其中之一，給予卵巢癌患者和健康人卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫的鑒別診斷更準(zhǔn)確的工具。它也可以幫助臨床醫(yī)生在隨訪的患者晚期患子宮內(nèi)膜異位考慮到病變惡變的可能性。在超聲檢測卵巢腫塊的患者，血清HE4與CA125同時升高提示卵巢癌的存在，而CA125升高但HE4不升高將認(rèn)為晚期卵巢子宮內(nèi)膜異位或其他良性疾病。此外，升高的血清HE4濃度與正常的CA125濃度認(rèn)為卵巢癌或可能其它類型癌癥的存在，例如子宮內(nèi)膜癌。

卵巢癌和子宮內(nèi)膜異位癥之間的高度特異性分化的最大好處可能在發(fā)現(xiàn)在早期非癥狀期的卵巢癌。卵巢癌大部分被確診在晚期，并具有非常低的生存率。與此相反，I期疾病局限于卵巢的患者5年存活率為90%以上。這強(qiáng)調(diào)了檢測卵巢癌在早期階段以降低死亡率的重要性。

總之，HE4血清濃度是一種新型的生物標(biāo)志物用于卵巢癌，在患者的卵巢子宮內(nèi)膜異位或任何其他類型的子宮內(nèi)膜異位癥沒有升高，而血清CA125濃度在晚期子宮內(nèi)膜異位癥增加。因此，血清HE4濃度是一個有價值的指標(biāo)，以更好地鑒別卵巢惡性腫瘤與那些來自良性卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者。

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