欒 倩，劉 蕾，劉君星，馬小茹，王芳芳，梁衍鋒，吳佳梅，王淑秋

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，黑龍江佳木斯154007)

大鼠絲裂原活化蛋白激酶1/2(ERK1/2)，在腦內(nèi)含量豐富，可被激活磷酸化參與一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病，靈芝孢子粉已證實有抗癲癇作用，靈芝酸作為靈芝孢子粉的一種有效成分，其作用機制與ERK1/2磷酸化水平是否有關(guān)有待進(jìn)一步探討。本實驗擬觀察靈芝酸對ERK1/2磷酸化水平的影響，探討靈芝酸抗癲癇的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物與試劑：24h內(nèi)新生Wistar大鼠，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物中心。種植培養(yǎng)液：NB培養(yǎng)基(Cat.No.21103049，Gibco)，2%B-27(Cat.No.17504044，Gibco)，0.5mmol/L的L-谷氨酰胺，10%的FBS，青霉素-鏈霉素溶液；維持培養(yǎng)液：NB培養(yǎng)基，2%的B-27，0.5mmol/L的L-谷氨酰胺，青霉素-鏈霉素溶液；D-Hanks液；胰蛋白酶；大鼠絲裂原活化蛋白激酶1/2酶聯(lián)免疫分析試劑盒；NSE抗體(Cat.No-BA0535，Wuhan Boster Bio-Engineering Ltd，China)；山羊抗兔FITC熒光二抗(Cat.No.BA1105，Wuhan Boster Bio-Engineering Ltd，China)。

1.1.2 儀器：37℃恒溫箱；酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek公司)，激光共聚焦顯微鏡FV1000(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)與鑒定

取24h新生大鼠，迅速端頭取腦，分離出海馬組織放入冷的D-Hanks液中漂洗3次，將組織塊剪成1mm3的碎塊，加入500μL的0.125%胰蛋白酶，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化3～4min后取出，迅速加入等量種植液終止消化，輕輕吹打成懸液，加入離心管1000r/min離心5min，棄上清，加種植液，巴氏滴管反復(fù)輕輕吹打，200目篩網(wǎng)過濾，去少量細(xì)胞計數(shù)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后全量換成維持液，以后每2～3天半兩換液。取出培養(yǎng)9d的神經(jīng)細(xì)胞，吸掉培養(yǎng)液用0.01molPBS洗2遍，然后加入兔抗鼠NSE抗體孵育一抗，放在4℃冰箱過夜，取出在避光條件下，加上山羊抗兔FITC熒光二抗，在熒光顯微鏡下對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。

1.2.2 海馬神經(jīng)元模型建立

將培養(yǎng)至第9d的海馬神經(jīng)元，全液更換成無鎂細(xì)胞外液(124 mmol NaCl，3.3 mmol KCl，26mmol NaHCO3，1.2mmol KH2PO4，2.5mmol CaCl2，10mmol Glucose，pH7.2 ～ 7.4，290+10mOsm)處理3h，即得海馬神經(jīng)元的癲癇樣放電模型，再恢復(fù)正常培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法測定靈芝酸對海馬神經(jīng)元最大無毒濃度

將濃度約為1×105/mL細(xì)胞懸液加入到96孔板中培養(yǎng)至第9d，加入不同濃度的無菌靈芝酸培養(yǎng)液混懸液，終濃度為 5，10，20，40，80，160，320，640μg/mL，每組設(shè) 8 個復(fù)孔，同時設(shè)立正常細(xì)胞對照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)觀察24h。每孔加入20μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。然后每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)后在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測每個孔的吸光度值，OD490nm。經(jīng)測算取靈芝酸最適無毒濃度20μg/mL，80μg/mL，320μg/mL。

1.2.4 靈芝酸最適無毒濃度分組

將海馬神經(jīng)元接種于35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)至第9天時，隨機選取培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分組：(1)正常對照組：將維持培養(yǎng)液全液換成正常細(xì)胞外液處理3h，然后恢復(fù)正常培養(yǎng)3h后取材；(2)模型組：將維持培養(yǎng)液全液換成無鎂細(xì)胞外液處理3h，然后恢復(fù)正常培養(yǎng)3h后取材［1］；(3)治療組：將維持培養(yǎng)液全液換成無鎂細(xì)胞外液處理3h，全液再換成維持培養(yǎng)液配制的靈芝孢子粉混懸液(濃度為20mg/m L，80mg/mL，320mg/mL)處理3h后取材。

1.2.5 ELISA分析

用PBS稀釋細(xì)胞懸液，通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞，離心收集細(xì)胞內(nèi)成分。在酶標(biāo)包被板上加樣、溫育、洗滌、終止，每組樣品重復(fù)3個復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品OD值代入方程式，計算出查出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即樣品的實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差()表示，應(yīng)用IBM SPSS 21統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元NSE鑒定

經(jīng)NSE免疫熒光染色顯示，第9天神經(jīng)元發(fā)育成熟，神經(jīng)元胞體飽滿，突起增大，成團狀聚集、交織成網(wǎng)。

2.2 MTT檢測靈芝酸對海馬神經(jīng)元最大無毒濃度

隨著靈芝酸濃度的不斷增加，靈芝酸對海馬神經(jīng)元細(xì)胞的最適無毒濃度為80μg/m L，因此本實驗采用20μg/m L，80μg/mL，320μg/mL 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 酶聯(lián)免疫分析ERK1／2磷酸化水平的表達(dá)

結(jié)果顯示各實驗組中均有ERK1／2的表達(dá)，模型組ERK1／2的表達(dá)高于正常對照組（P＜0.05）；并且各治療組均能降低ERK1／2磷酸化水平，差異都有統(tǒng)計學(xué)意義；各濃靈芝酸組之間比較，差異都有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各實驗組中均有ERK1／2的表達(dá)

3 討論

我們采用NB培養(yǎng)基聯(lián)合B27添加劑離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)第4天加入阿糖胞苷，這種培養(yǎng)方式獲得了相對純度較高的海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)至第9天，神經(jīng)元生長更加旺盛，胞體增大，突起增多伸長，粗大，交織成網(wǎng)狀，此時所培養(yǎng)的神經(jīng)元是生長的最旺盛階段［2］。NSE免疫熒光技術(shù)對離體培養(yǎng)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，利用無鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)得到離體海馬神經(jīng)元的永久性癲癇樣放電模型，可用于細(xì)胞水平上神經(jīng)系統(tǒng)功能、結(jié)構(gòu)的研究。通過 MTT方法結(jié)果的觀察，得出靈芝酸的最適高中低無毒濃度（20μg／m L，80μg／m L，320μg／m L）。

ERK1／2是MAPK家族中研究最早最為透徹的一個激酶，通過大量體內(nèi)和體外研究，ERK1／2在多種癲癇模型實驗中已證實參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)展。癲癇是神經(jīng)科常見疾患，盡管目前臨床有多種治療方法，但主要的治療手段仍是抗癲癇藥物治療控制其發(fā)作［3］。近年來，中藥在抗癲癇方面研究不斷加深，本研究通過離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，觀察靈芝酸對無鎂細(xì)胞外液致癇性細(xì)胞模型中ERK1／2磷酸化的表達(dá)情況，表明靈芝酸能抑制海馬神經(jīng)元中ERK1／2通路的激活，為研究靈芝酸對抗癲癇作用提供了實驗依據(jù)，但目前對苔蘚纖維的負(fù)向調(diào)節(jié)機制還有待研究，可能與其上游激活因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）有關(guān)［4，5］。

［1］趙春霞，王淑秋，叢嶺，等.靈芝孢子粉對無鎂活化海馬神經(jīng)元NGF的影響［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33（4）：8-15

［2］張金波，王淑秋，朱金玲，等.大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32（4）：20-21

［3］趙秀鶴，遲兆富，王勝軍，等.ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在癲癇大鼠腦部作用的研究［J］.神經(jīng)損傷與功能重建，2006，1（1）：14-16

［4］夏杰，陳陽美.MAPKERK1／2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在實驗性癲癇大鼠海馬結(jié)構(gòu)的激活［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，30（3）：363-365

［5］劉華.丙戊酸對癲癇后ERK1／2介導(dǎo)的苔蘚纖維出芽干預(yù)的實驗研究［D］.［碩士學(xué)位論文］.重慶醫(yī)科大學(xué)，2008