高 麗, 諶 顏, 扈廷茂, 李光鵬

內(nèi)蒙古大學(xué)生殖生物學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 呼和浩特 010021

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，也稱(chēng)為生長(zhǎng)分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF8)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員。TGF-β超家族成員在維持組織穩(wěn)態(tài)和對(duì)胚胎發(fā)育、骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在研究比利時(shí)蘭牛和皮埃蒙特牛時(shí)發(fā)現(xiàn)，這兩種牛的一些個(gè)體，其臀部、上臂、大腿、胸以及起支撐作用的肌肉群非常發(fā)達(dá)，人們把這種現(xiàn)象稱(chēng)之為雙肌臀現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與MSTN基因有關(guān)。本文對(duì)MSTN基因在哺乳動(dòng)物中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)闡述和討論了MSTN通路與其他通路之間的相互關(guān)系，及試驗(yàn)條件下MSTN對(duì)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的作用等。

1 肌肉生長(zhǎng)抑制素的功能

在研究具有雙肌臀現(xiàn)象的比利時(shí)藍(lán)牛和皮爾蒙特牛時(shí)，發(fā)現(xiàn)比利時(shí)藍(lán)牛的MSTN基因第3外顯子缺失了11 bp(937～947)，這一突變使得自缺失區(qū)段后面的第14 個(gè)密碼子開(kāi)始的翻譯功能被破壞，因此C末端只有7個(gè)氨基酸可以翻譯，其余的102個(gè)氨基酸(274～375)都將丟失，從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)功能的缺失[1]。在皮爾蒙特雙肌臀牛中，檢測(cè)出2個(gè)點(diǎn)突變，其中一個(gè)突變是第3號(hào)外顯子的1 056 G→A突變，導(dǎo)致該基因所編碼的氨基酸由半胱氨酸突變成為酪氨酸，結(jié)果肌肉生長(zhǎng)抑制素的功能幾乎全部喪失；通過(guò)Southern雜交分析表明，該雙肌牛在這個(gè)位點(diǎn)是純合的。另一個(gè)突變的外顯子(C→A)，導(dǎo)致編碼的亮氨酸突變成為苯丙氨酸。在MSTN無(wú)義動(dòng)物中，骨骼肌顯著增加，與野生型相比其脂肪含量顯著下降[1]。在自然突變的牛、羊、狗和人以及抑制這個(gè)蛋白功能的成體鼠中都觀察到了相似的現(xiàn)象，而過(guò)表達(dá)MSTN會(huì)導(dǎo)致肌肉量的減少。Taylor等[2]研究發(fā)現(xiàn)，重組MSTN 可以阻礙細(xì)胞增生，也會(huì)抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致肌肉不發(fā)達(dá)。Ríos等[3]將MSTN蛋白加入培養(yǎng)基時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的抑制作用與所加蛋白濃度的增加成正比；用小鼠MSTN 的cDNA 重組體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞，可以有效地抑制細(xì)胞增殖。這些研究結(jié)果都表明MSTN對(duì)于骨骼肌生長(zhǎng)是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

在胚胎發(fā)育階段，MSTN只在骨骼肌中表達(dá)，控制成肌細(xì)胞分化和增殖。但在成年期，它不僅在骨骼肌中表達(dá)，也在其他組織中表達(dá)(例如心臟、脂肪和乳腺組織)。在健康心臟中MSTN的表達(dá)是很低的，而且大多是在浦肯野氏纖維中表達(dá)，而在心肌細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到[4,5]。在發(fā)生心肌梗塞的羊中發(fā)現(xiàn)MSTN表達(dá)有提高，但其表達(dá)只局限在損傷的區(qū)域。George等[4]報(bào)道了在衰竭的心臟中MSTN表達(dá)水平增加，這一結(jié)果與Heineke等[5]的研究結(jié)果一致，證明通過(guò)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的MSTN可以刺激心臟的肌肉萎縮。這些研究表明MSTN對(duì)于心肌細(xì)胞也是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，但是其具體機(jī)制與骨骼肌中是否一致還有待進(jìn)一步的研究。

2 肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

MSTN是一種分泌型多肽，MSTN cDNA由一個(gè)開(kāi)放閱讀框(opening reading frame，ORF)和可以編碼376個(gè)氨基酸的核苷酸序列組成，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。未經(jīng)過(guò)剪切加工的全長(zhǎng)蛋白為52 kDa，具有TGF-β超家族共有的分子結(jié)構(gòu)，即由信號(hào)肽、編碼前肽(26 kDa)的N-末端區(qū)和編碼成熟肽(12.5 kDa)的 C-末端區(qū)三部分組成52 kDa的前體蛋白，在N-末端區(qū)和C-末端區(qū)之間有一個(gè)蛋白酶解加工位點(diǎn)。52 kDa的前肽經(jīng)過(guò)蛋白酶切加工后，會(huì)釋放出26 kDa的活性肽，這種加工后的成熟肽與特異性受體結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6]。

哺乳動(dòng)物的MSTN在結(jié)構(gòu)上高度保守，羊、豬、馬和人等不同物種的MSTN基因的編碼區(qū)高度保守，牛和綿羊僅有1～3個(gè)堿基的差別。對(duì)牛的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因全序列分析顯示，該基因包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。第1和第2個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別為506 bp和374 bp。第3個(gè)外顯子的長(zhǎng)度隨著poly(A)尾巴位點(diǎn)的不同而有所不同(1 701 bp、1 812 bp或1 887 bp)。牛MSTN基因序列分析表明僅有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄起始密碼子ATG上游133 bp處。在綿羊中存在一個(gè)接合突變體，它移除了一部分受體結(jié)合區(qū)域的編碼序列，包含256個(gè)氨基酸。這個(gè)接合突變體是MSTN基因的拮抗因子，其所編碼的蛋白可以與MSTN蛋白相結(jié)合從而發(fā)揮拮抗作用，抑制MSTN介導(dǎo)的信號(hào)通路[7]。

3 肌肉生長(zhǎng)抑制素作用的信號(hào)通路

與其他TGF-β超家族成員一樣，MSTN通過(guò)激活素受體來(lái)介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)?；罨腗STN與激活素受體ActⅡB結(jié)合發(fā)揮功能，抑制細(xì)胞增殖和分化。激活素受體是跨膜的絲蘇氨酸激酶，分為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體。Ⅰ型受體ActRⅠ(ALK4和ALK5)有唯一的Gs區(qū)域，該區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)與激酶區(qū)域相鄰；而ActRⅡ受體沒(méi)有這一區(qū)域[8]。MSTN與ActRⅡB結(jié)合后再與Ⅰ型受體組裝，使其Gs區(qū)域磷酸化。因此，MSTN的信號(hào)是通過(guò)激活兩個(gè)受體的復(fù)合物來(lái)介導(dǎo)的[8]。

MSTN通過(guò)ActRⅡB發(fā)揮的信號(hào)調(diào)控對(duì)于骨骼肌生長(zhǎng)是決定性的。研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的ActRⅡB自然缺失會(huì)導(dǎo)致肌肉含量顯著的增加；在鼠類(lèi)中，阻斷這一受體也得到了相同的結(jié)果。但是研究也發(fā)現(xiàn)，在MSTN敲除的小鼠中用sActRⅡB(ActRⅡB的可溶形式，可以作為MSTN的誘餌受體)處理，肌肉量增加15％～25％。這表明除了MSTN之外，還至少存在一種配體能夠與受體結(jié)合，來(lái)調(diào)控骨骼肌的量。這就可以解釋為什么在臨床試驗(yàn)中阻礙MSTN對(duì)于肌肉重量沒(méi)有顯著的影響[9]。該發(fā)現(xiàn)表明，MSTN不是調(diào)控肌肉萎縮的信號(hào)通路中的唯一配體。還有研究表明，在一個(gè)特定的水平上，MSTN可以阻止惡質(zhì)病中肌肉萎縮[10]。

骨骼肌含量的維持是通過(guò)兩種分子機(jī)制起作用：蛋白合成和蛋白降解。盡管關(guān)于MSTN在調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)方面了解較多，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚。有研究表明，MSTN與ActRⅡB的結(jié)合導(dǎo)致Smad2或Smad3的羥基端區(qū)域2個(gè)絲氨酸殘基磷酸化，使得Smad2/Smad3與Smad4結(jié)合形成異源二聚體，這個(gè)二聚體可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。最近的研究表明，幾個(gè)MSTN的結(jié)合蛋白，包括GDF相關(guān)的血清蛋白1(GASP-1)、血清蛋白2(GASP-2)和卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)STN)可以抑制MSTN與ActRⅡB的結(jié)合而調(diào)控MSTN信號(hào)通路[12]。

肌肉細(xì)胞的決定和最終分化都是由一個(gè)具有4個(gè)生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factor，MRF)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所支持：生肌因子5(MYF5)、肌肉特異性調(diào)控因子4、6(MRF4、MYF6)、成肌細(xì)胞決定蛋白(myoblast determination protein， MyoD)和肌細(xì)胞生成素(myogenin，MyoG)。MYF5和MyoD被認(rèn)為是決定因子，而MyoG是對(duì)于最終成肌細(xì)胞分化定型起到關(guān)鍵作用[13]。成對(duì)盒蛋白3(paired box 3，Pax3)基因作為MRF的上游基因，能通過(guò)控制Dmrt2的表達(dá)而激活MYF5，Dmrt2反過(guò)來(lái)會(huì)激活體節(jié)中Myf5的增強(qiáng)子[14]。缺失Pax3和MYF5的小鼠，其軀體肌肉幾乎不發(fā)育，MyoD的表達(dá)會(huì)下調(diào)。這表明MyoD的表達(dá)依賴(lài)于Pax3或MYF5[15]。目前還不能確切了解Pax3怎樣激活MyoD的表達(dá)，但使用前體體節(jié)外植塊的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明WNT信號(hào)通路通過(guò)依賴(lài)于Pax3的方式調(diào)控MyoD的表達(dá)[16]。

由此可以初步得出，MSTN的功能發(fā)揮可能是通過(guò)以下方式進(jìn)行的：活化的MSTN與其受體ActⅡB結(jié)合后使Smad2/3磷酸化，Smad2/3是一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶，可以通過(guò)溴結(jié)構(gòu)域蛋白BRD4調(diào)控MSTN的表達(dá)[17]。磷酸化的Smad2/3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，而Smad7會(huì)抑制這一過(guò)程[11]。形成的Smad2/3和Smad4的復(fù)合物通過(guò)抑制Pax3的活性從而抑制MYF5/MRF4的活性，進(jìn)而抑制MyoD和MyoG的活性，并最終抑制肌生成[15]。

4 Myostatin通路與其他信號(hào)通路之間的關(guān)系

MSTN除了能夠與其受體結(jié)合從而發(fā)揮功能外，還可以與其他信號(hào)通路產(chǎn)生對(duì)話(huà)。肌肉生長(zhǎng)的一個(gè)主要的正調(diào)控因子是胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)[18]。在正常條件下，IGF-1信號(hào)似乎是主導(dǎo)的而且會(huì)阻斷MSTN通路。而且一般認(rèn)為，IGF-1是哺乳動(dòng)物真正的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，研究已經(jīng)表明哺乳動(dòng)物的IGF-1基因是介導(dǎo)生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)發(fā)揮促生長(zhǎng)效應(yīng)的主要因子。GH通過(guò)與生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor，GHR)結(jié)合，可以產(chǎn)生IGF-1，從而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育[19]。IGF-1調(diào)控MSTN信號(hào)途徑的機(jī)制包括對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的抑制，轉(zhuǎn)錄因子的抑制是通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路激活而導(dǎo)致的磷酸化所實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)IGF-1與其配體結(jié)合后，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，使Akt磷酸化，導(dǎo)致叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box class O，F(xiàn)oxO)的活性受到抑制，使其停留在細(xì)胞質(zhì)中而不發(fā)揮作用，從而抑制肌肉萎縮基因表達(dá)。而MSTN可以通過(guò)抑制Akt磷酸化，從而提高FoxO活性，提高肌肉萎縮基因的表達(dá)[20]。

Akt磷酸化后會(huì)導(dǎo)致GSK-3β的激活，周期蛋白E是細(xì)胞周期中G1期的重要成分，也通過(guò)PI3K/Akt通路受到調(diào)控[21]。MSTN下調(diào)后，使得 Akt磷酸化而抑制cyclin E的磷酸化[22]，使cyclin E與CDK2結(jié)合激活了CDK2的活性，解除Rb蛋白對(duì)S期基因轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制，促進(jìn)DNA復(fù)制起始復(fù)合物的組裝、著絲粒復(fù)制，以及S期組蛋白基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞通過(guò)G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)入S期，從而促進(jìn)增殖和分化。

mTOR是Akt下游的一個(gè)激酶，會(huì)使4E-BP1和p70s6k磷酸化，因此會(huì)誘導(dǎo)蛋白合成的起始[23，24]。在MSTN敲除的小鼠中，Akt/mTOR/p70s6K信號(hào)增加[25]，所以激活的Akt誘導(dǎo)產(chǎn)生mTOR信號(hào)，導(dǎo)致蛋白合成。

TGF-β信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路之間也存在相互作用，激活Notch信號(hào)通路可以抑制TGF-β信號(hào)，下調(diào)MSTN的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致肌肉增加[26]。Dlk1(delta-like 1 homolog)是Nocth信號(hào)通路的配體， Dlk1通過(guò)與MSTN信號(hào)通路發(fā)揮作用來(lái)抑制肌管形成，從而抑制成肌細(xì)胞的分化[27]，但是具體機(jī)制尚不清楚。還有研究表明，在肌肉形成過(guò)程中存在Wnt信號(hào)，可以通過(guò)依賴(lài)和不依賴(lài)β-catenin的方式發(fā)揮作用，雖然其與MSTN的信號(hào)通路之間作用機(jī)制還不清楚，但是已經(jīng)證明了wnt4可以通過(guò)抑制MSTN活性而刺激肌源性分化[28]。

關(guān)于MSTN與其他因子之間的互作關(guān)系，在總結(jié)了已有研究的基礎(chǔ)上，我們做了一些補(bǔ)充和修改。如圖1所示，有4條通路調(diào)控肌肉發(fā)育與分化。①FSTN抑制MSTN與其受體ActⅡB的結(jié)合，從而抑制MSTN信號(hào)通路[29]。②當(dāng)活化的MSTN與其受體ActⅡB結(jié)合后，使Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物[11]，Smad7會(huì)抑制這一過(guò)程。形成的Smad2/3和Smad4的復(fù)合物抑制Pax3的活性，從而抑制MYF5/MRF4活性，抑制MyoD和MyoG的活性[15]，從而抑制肌生成。③當(dāng)活化的MSTN與其受體ActⅡB結(jié)合后，會(huì)抑制PI3K活性，抑制Akt的磷酸化[20]，從而激活FoxO。FoxO進(jìn)入細(xì)胞核，激活MuRF1/atrogin1，導(dǎo)致蛋白降解[14，30，31]；活化的FoxO與Smad2/3和Smad4的復(fù)合物相互作用，導(dǎo)致蛋白的降解[32]，從而抑制肌肉生成。④GH與其受體結(jié)合產(chǎn)生IGF-1，IGF-1與其受體結(jié)合激活PI3K，激活的PI3K可以使Akt磷酸化，進(jìn)而使FoxO磷酸化抑制其活性；激活GSK-3β抑制cyclin E的磷酸化，促進(jìn)cyclin E與CDK2結(jié)合成為復(fù)合體，從而激活CDK2，促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的過(guò)渡，促進(jìn)細(xì)胞增殖；激活mTOR促進(jìn)蛋白合成，促進(jìn)肌生成[21]。

圖1 在肌肉發(fā)育與分化過(guò)程中MSTN與其他因子之間的互作關(guān)系

5 MSTN敲減后對(duì)于肌肉發(fā)育相關(guān)基因的影響

在小鼠中，MSTN無(wú)義的動(dòng)物其骨骼肌顯著增加，且與野生型相比其脂肪含量顯著下降[1，33]。Ríos等[3]發(fā)現(xiàn)，鼠MSTN的cDNA重組體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞時(shí)，可以有效地抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)室采用過(guò)表達(dá)載體分別與干擾載體和無(wú)義干擾載體共轉(zhuǎn)染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)MSTN下調(diào)后，引起foxO1、dlk1基因的表達(dá)量下調(diào)，而FSTN、IGF1、myoD、myoG、GHR、CDK2和pax3基因的表達(dá)量上調(diào)。

5.1MSTN和Dlk1

Dlk1(delta-like 1 homolog)是表皮生長(zhǎng)因子家族成員[34]，Dlk1在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。有研究證明，Dlk1通過(guò)與MSTN信號(hào)通路共同發(fā)揮作用來(lái)抑制肌管形成，從而抑制成肌細(xì)胞的分化[27]，但是具體機(jī)制尚不清楚。該研究同時(shí)證明MSTN與Dlk1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[27]，即MSTN是肌肉發(fā)育負(fù)調(diào)控因子，Dlk1同樣可以抑制成肌細(xì)胞分化。由此可以認(rèn)為MSTN與Dlk1發(fā)揮協(xié)同作用。

5.2MSTN和FoxO1

FoxO在骨骼肌發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控中起到關(guān)鍵作用[34]。轉(zhuǎn)錄因子FoxO是Fox家族重要成員，包括FoxO1、FoxO3、 FoxO4和FoxO6[35]。研究證明MSTN可以抑制Akt磷酸化，從而提高FoxO活性，達(dá)到提高肌肉萎縮基因表達(dá)的目的[20]。在MSTN下調(diào)后，也下調(diào)了FoxO1的表達(dá)。這可能是因?yàn)镕oxO1可以結(jié)合于MSTN啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)啟動(dòng)子活性，從而上調(diào)MSTN基因的表達(dá)[14]。所以在MSTN表達(dá)下調(diào)的情況下，F(xiàn)oxO1的活性也會(huì)得到負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而其表達(dá)量下降。

5.3MSTN和FSTN

FSTN是一種單鏈糖蛋白，是TGF-β超家族成員的天然拮抗劑。FSTN與MSTN結(jié)合通過(guò)抑制其與受體的結(jié)合而抑制其活性[36]。在體內(nèi)過(guò)表達(dá)FSTN導(dǎo)致肌肉肥大，與MSTN無(wú)義的小鼠中觀察到的現(xiàn)象一致[37]。FSTN突變的純合體小鼠肌肉量減少[38]，表明FSTN在調(diào)控肌肉生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，在牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中，敲減MSTN后，F(xiàn)STN的表達(dá)量得到了提高。

5.4MSTN和IGF-1、GHR

肌肉生長(zhǎng)的一個(gè)主要的正調(diào)控因子是IGF-1。在正常條件下，IGF-1信號(hào)似乎是主導(dǎo)的，而且會(huì)阻斷MSTN的通路[39]。GH通過(guò)與GHR結(jié)合，可以產(chǎn)生IGF-1，IGF-1和GHR對(duì)骨骼肌發(fā)育起到正調(diào)控作用，可以促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育[40]。在下調(diào)MSTN后，定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IGF-1和GHR基因表達(dá)得到了上調(diào)[41]。

5.5MSTN和Pax3、MyoD、MyoG

MyoD和MYF5是肌肉特異的轉(zhuǎn)錄因子，組成一個(gè)交叉的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于肌肉細(xì)胞的決定和分化起到核心作用[42]，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的破裂會(huì)完全取消骨骼肌的形成。MYF5和MyoD基因被認(rèn)為是決定基因，MyoG是肌細(xì)胞終末端分化的關(guān)鍵因子，促進(jìn)單核成肌細(xì)胞向多核肌細(xì)胞的融合過(guò)程[43]。在敲減MSTN后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Pax3、MyoD和MyoG的表達(dá)量都得到了下調(diào)。這可能是因?yàn)镸STN通過(guò)TGF-β超家族信號(hào)蛋白Smad3介導(dǎo)抑制Pax3的下調(diào)[44]，再由Pax3介導(dǎo)MyoD和MyoG的下調(diào)，從而抑制肌分化[45，46]。

5.6MSTN和CDK2

CDK2 是細(xì)胞周期因子[47]，研究發(fā)現(xiàn)將CDK2 的抗體注入細(xì)胞或是抑制CDK2 的表達(dá)后，細(xì)胞會(huì)停留在G1期[48], 因此認(rèn)為CDK2 是細(xì)胞進(jìn)入和通過(guò)細(xì)胞周期S期所必需的。在下調(diào)MSTN后，CDK2的活性增強(qiáng)。這可能是由MSTN下調(diào)后，使得Akt磷酸化，從而抑制cyclin E的磷酸化[49]，使cyclin E與CDK2結(jié)合，從而激活了CDK2的活性，解除了Rb蛋白對(duì)S期的基因轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制，促進(jìn)DNA復(fù)制起始復(fù)合物的組裝、著絲粒復(fù)制，以及S期組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞通過(guò)G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)入S期，從而促進(jìn)增殖和分化。

6 肌肉生長(zhǎng)抑制素基因操作的應(yīng)用研究

在山羊成肌細(xì)胞[50]、成纖維細(xì)胞[51]、雞胚胎成纖維細(xì)胞[52]以及綿羊胚胎中[53]用RNAi技術(shù)干擾MSTN基因都會(huì)導(dǎo)致MSTN表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖。Hu等[54]獲得了RNAi干擾MSTN的轉(zhuǎn)基因羊，其MSTN的表達(dá)被明顯抑制，轉(zhuǎn)基因羊體重增加加快，肌纖維直徑增加。Kinouchi等[55]通過(guò)去端肽膠原修飾siRNA，使其在體外激活并注射入小鼠骨骼肌中，這種方法解決了傳統(tǒng)質(zhì)粒載體的不安全因素，是臨床應(yīng)用的一個(gè)有效手段。Zheng等[56]在綿羊胎兒成肌細(xì)胞中通過(guò)同源重組技術(shù)成功地定點(diǎn)誘變了陶賽特羊的MSTN基因，使其3′UTR區(qū)上游281 bp的G突變成A，并證明該突變可以有效地下調(diào)MSTN基因的表達(dá)。Zhou等[57]通過(guò)鋅指核酶技術(shù)敲除了五指山小型豬的MSTN基因，并驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)敲除MSTN基因不會(huì)對(duì)其胚胎的發(fā)育潛力造成不利影響，這為生產(chǎn)敲除MSTN的家畜物種提供了安全保障。Xu等[58]設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)于哺乳動(dòng)物MSTN基因保守區(qū)的TALEN序列，并證明這段TALEN序列在人、牛和鼠的細(xì)胞系中可以高效特異地敲減MSTN的表達(dá)。

敲減或敲除MSTN能夠促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)，已經(jīng)成為培育高產(chǎn)肉量家畜品種的技術(shù)手段。Luo等[59]利用鋅指核酸酶技術(shù)成功培育出敲除MSTN的新型魯西黃牛個(gè)體，具有明顯的雙肌臀性狀。MSTN基因的變化對(duì)于動(dòng)物及人體健康也非常重要。通過(guò)對(duì)MSTN基因進(jìn)行基因操作或使用抗體敲減或敲除MSTN，能夠增加肌肉量和維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)以緩解肌肉減少性肥胖[60]。Jackson等[61]研究發(fā)現(xiàn)，在中年鼠中缺失MSTN，其脂肪含量明顯下降，瘦肉明顯增加，這表明敲減MSTN可以減緩老化帶來(lái)的病理學(xué)癥狀；但其心臟相對(duì)于對(duì)照組也較重，這可能會(huì)引起擴(kuò)張性心臟疾病，所以還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明敲減MSTN對(duì)于心臟功能是否有不利影響。目前，在動(dòng)物模型中已經(jīng)有用抗MSTN的療法治療肌肉萎縮癥的報(bào)道。MSTN主要的抑制劑包括MSTN前肽、抗體以及GASP1和FSTN。抑制MSTN增加骨骼肌含量后可以有效抑制糖尿病的發(fā)生，緩解食欲過(guò)盛等現(xiàn)象[62]。另外，有研究表明，MSTN在許多腫瘤細(xì)胞系中也有表達(dá)[63]，這或許提示我們癌癥的發(fā)生與肌肉的發(fā)育存在關(guān)聯(lián)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，MSTN可以引發(fā)明顯的線(xiàn)粒體代謝的改變，并發(fā)現(xiàn)MSTN在調(diào)控癌細(xì)胞的線(xiàn)粒體代謝和凋亡中發(fā)揮重要功能[64]。因此，未來(lái)對(duì)于MSTN的研究也應(yīng)該著重于探索MSTN控制的肌肉發(fā)育與機(jī)體其他組織的代謝通路之間的相互作用，只有把機(jī)體不同組織之間相互關(guān)聯(lián)研究清楚后，才能夠更好的應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)與人類(lèi)臨床實(shí)踐。

綜上所述，MSTN基因在肌肉發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，深入研究MSTN基因作用機(jī)制及其與其他信號(hào)通路的互作關(guān)系，對(duì)改善動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)性狀和培育高產(chǎn)肉量家畜品種有重要的指導(dǎo)作用，對(duì)人類(lèi)肌肉萎縮、老化、糖尿病及其他相關(guān)疾病甚至癌癥的治療具有重要意義。

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