金安娜

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510650）

李建雄

（中國(guó)科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510650；長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

田志宏

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

成熟的miRNA（microRNA）是一類由19～24個(gè)核苷酸 （nt）組成的內(nèi)源非編碼小分子單鏈RNA，其5′端為磷酸基團(tuán)，3′端為羥基基團(tuán)［1］。相關(guān)資料表明，多數(shù)miRNA基因位于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子中或是基因間序列中，少部分位于外顯子中［1－2］；miRNA基因呈多順?lè)醋有问脚挪?。同一基因家族的miRNA具有很高的同源性。由于miRNA進(jìn)化上的保守性使得不同物種之間的miRNA也具有較高的同源性，如擬南芥 （Arabidopsis thaliana）和水稻 （Oryza sativa）。miRNA的表達(dá)具有時(shí)空特異性，例如不同發(fā)育時(shí)期、不同組織器官中的表達(dá)量存在差異。同一個(gè)miRNA可作用于多個(gè)不同的靶基因，同一個(gè)靶基因也可能受多個(gè)miRNA調(diào)控。

1 成熟miRNA的生成過(guò)程

miRNA廣泛存在于各種真核生物中，其在植物中的合成過(guò)程可簡(jiǎn)述如下:miRNA基因首先在RNA聚合酶II（Pol II）的作用下轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——長(zhǎng)鏈的pri－miRNA，隨后在其5′端和3′端分別形成帽子結(jié)構(gòu)和poly（A）結(jié)構(gòu)。此時(shí)的長(zhǎng)鏈pri－miRNA通過(guò)分子內(nèi)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成具有特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、不完全互補(bǔ)的雙鏈RNA。接著由具有識(shí)別pri－miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Dicer Like 1（DCL 1）和雙鏈RNA結(jié)合蛋白HYPONASTIC LEAVES1（HYL1）的共同作用下剪切成含有穩(wěn)定的莖－環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)前體 miRNA，即pre－miRNA［2］。隨后 DLC1－HYL1復(fù)合體再將pre－miRNA 剪切形成 miRNA／miRNA＊復(fù)合物。此時(shí)，HUA Enhancer I（HEN 1）專一的將雙鏈的miRNA／miRNA＊3′末端進(jìn)行甲基化修飾，以保護(hù)其穩(wěn)定性防止被酶或被polyU降解［3］。接著由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HST （HASTY）將雙鏈的miRNA／miRNA＊從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)的miRNA仍為雙鏈結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中隨后開(kāi)始解鏈，其中單鏈miRNA＊5′端由于穩(wěn)定性較差被降解，而成熟的單鏈miRNA在ARGONAUTE 1（AGO 1）蛋白的輔助下被特異地整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISC（RNA induced silencing complex）中，形成非對(duì)稱的RISC復(fù)合物，并以堿基互補(bǔ)的方式與匹配的靶基因mRNA相結(jié)合，從而介導(dǎo)靶基因特異位點(diǎn)的切割或抑制翻譯，進(jìn)而調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá) （圖1）［1，4］。

圖1 成熟miRNA的形成過(guò)程

2 miRNA對(duì)靶基因mRNA的調(diào)控類型

通常情況下，miRNA與靶基因mRNA的作用模式主要有2種。一種作用模式是將成熟的單鏈miRNA與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)不完全互補(bǔ)配對(duì)，從而阻斷靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［5］。這種方式主要影響蛋白表達(dá)水平而不影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性。另一種作用模式是當(dāng)miRNA與靶基因mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則與miRNA相關(guān)的核糖核酸和RNA沉默復(fù)合物 （RISC）聯(lián)合作用降解靶基因 mRNA［1，5］。

3 miRNA的檢測(cè)技術(shù)

1993年，Lee等［6］在線蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA——可定時(shí)調(diào)控胚胎后期發(fā)育的lin－4基因。近年來(lái)，隨著miRNA的不斷發(fā)現(xiàn)，其檢測(cè)方法也得到了廣泛的拓展。目前miRNA的檢測(cè)方法大致可歸納為2類:（1）無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增的直接探針雜交法，如Northen blotting、Microarray等。（2）基于樣品擴(kuò)增反應(yīng)的檢測(cè)方法，如PCR與熒光染料SYBR GREEN的定量檢測(cè)法、滾環(huán)擴(kuò)增法 （RCA）、引物入侵法 （Invader）和克隆法等［7－8］。這里主要詳細(xì)介紹第二類方法中的采用熒光染料的定量PCR檢測(cè)技術(shù)。

3.1 polyA聚合酶加尾法檢測(cè)miRNA

polyA聚合酶加尾法 （poly（A）tailing assay）可按以下步驟進(jìn)行:poly（A）聚合酶 （PAP）在成熟的miRNA3′末端添加poly（A）尾巴；用5′端帶有接頭的poly（T）引物 （poly（T）Adapter）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成miR cDNA。此poly（T）Adapter引物 （5′－GCGAGCACAGAATTAATACGACTC ACTATAGG （T）12VN－3′）由2部分組成，一部分為poly（T）12VN （V＝ A，G，C；N＝ A，T，G，C），另一部分為隨后PCR擴(kuò)增設(shè)置的通用反向引物5′－GCGAGCACAGAATTAATACGAC－3′。以miR cDNA為模板，利用接頭的polyT引物 （polyT adapter）上的反向通用引物和miRNA特異的正向引物進(jìn)行SYBR GREEN實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增［9－10］（圖2）。

圖2 polyA聚合酶加尾法檢測(cè)miRNA表達(dá)量原理 （引自Shi et al［9］，2005）

3.2 引物延伸法檢測(cè)miRNA

引物延伸法 （primer extension assay，PE）利用一種新的寡聚核苷酸——鎖核酸 （locked nucletic acid，LNA）。LNA是一種特殊的雙環(huán)狀寡核苷酸衍生物，位于核酸的2′O，4′C可通過(guò)不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋并連接成環(huán)狀，以增加磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，加強(qiáng)DNA／RNA的雜交親和力［11］。該方法首先利用特異性引物 GSP （5′－CATGATCAGCTGGGCCAAGAXXXXXXX－3′，3′端 的 X為7～12個(gè)與miRNA反向互補(bǔ)的堿基）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成miR cDNA；以miR cDNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄引物5′上的正向通用引物 UP （5′－CATGATCAGCTGGGCCAAG－3′）和 含 有 2 個(gè)LNA修飾的且與miRNA互補(bǔ)配對(duì)的反向引物RP（大致16個(gè)堿基）進(jìn)行SYBR GREEN實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增［12］（圖3）。

圖3 引物延伸法檢測(cè)miRNA表達(dá)量原理（引自Raymond et al［12］，2005）

3.3 Multiplexed RT法檢測(cè)miRNA

Multiplexed RT法 （Multiplexed RT assay）的操作過(guò)程如下:將所需研究的相關(guān)miRNA的特異反轉(zhuǎn)錄引物 （RT Primer）等量混合，其過(guò)程類似于構(gòu)建1個(gè)RT引物庫(kù)，但只需進(jìn)行1次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)即可得到所需的miR cDNA。然后針對(duì)不同的miRNA設(shè)計(jì)特異的正反向引物，加入SYBR GREEN進(jìn)行實(shí) 時(shí) 定 量 PCR 擴(kuò) 增［7，12］。Multipl－exed RT法的特點(diǎn)在于可區(qū)分同一miRNA基因家族內(nèi)的不同成員；還可以檢測(cè)得到不同miRNA的表達(dá)量差異。該技術(shù)中的引物設(shè)計(jì)方法如下:RT引物由2部分組成，一部分為來(lái)自Wang的研究中提及的獨(dú)特標(biāo)簽序列22bp［13］；另一部分為miRNA 3′端的6～11個(gè)反向互補(bǔ)特異序列。Forward primer即為獨(dú)特標(biāo)簽序列 （22bp），Reverse primer由隨機(jī)序列 （4～11bp）和miRNA 5′端的正向特異序列 （21～22bp）組成。所設(shè)計(jì)的引物篩選條件為:TM值在61～63℃間，GC含量在45%～55%，避免引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物之間二級(jí)結(jié)構(gòu)等［13］（圖4）。

圖4 Multiplexed RT法檢測(cè)miRNA表達(dá)量原理（引自 Wang et al［13］，2009）

3.4 miR－Q法檢測(cè)miRNA

miR－Q法 （miR－Q assay）分3步進(jìn)行:首先，利用通過(guò)1個(gè)加尾的miRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物RT6－miR－x將 miRNA 反 轉(zhuǎn) 錄 成 加 尾 cDNA。RT6－miR－x （5′－TGTCAGGCAACCGTATTCACCGTGAGTGGTXXXXXX－3′）由2部分組成，一部分為通用引物 MP－fw 序列 （5′－TGTCAGGCAACCG－TATTCACC－3′），另一部分為 3′端的6個(gè)與miRNA反向互補(bǔ)的堿基。其 次， 引 入 short－miR－x－rev引物合成雙鏈 DNA。short－miR－x－rev引物 （5′－CGTCAGATGTCCGAGTAG AGGGGGAACGGCGXXXXXX－3′）由2部分組成，一部分為通用引物 MP－rev序列 （5′－CGTCAGA TGTCCGAGTAGAGG－3′），另一部分為3′端miRNA的自身6個(gè)堿基序列。最后，加入引物 MP－fw和 MP－rev進(jìn)行SYBR GREEN實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增［14］（圖5）。

圖5 miR－Q法檢測(cè)miRNA表達(dá)量原理（引自Sharbati Tehrani et al［14］，2008）

3.5 Stem－loop RT－qPCR法檢測(cè) miRNA

莖環(huán)法通過(guò)引入莖環(huán)從而延長(zhǎng)miRNA的長(zhǎng)度以便于片段的擴(kuò)增。Stemp－loop法通用莖環(huán)為5′－GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACXXXXXX－3′ （3′端 為 6 個(gè) 與miRNA反向互補(bǔ)的堿基），由44bp組成1個(gè)8核苷酸環(huán)和20核苷酸莖的結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄合成miR cDNA；其反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?16℃30min；30℃30s，42℃30s，50℃1s，60個(gè)循環(huán)；70℃10min。與miRNA互補(bǔ)配對(duì)的為正向引物Forward Primer，與莖環(huán)互補(bǔ)配對(duì)的通用引物Reverse Primer（5′－CCAGTGCAGGGTCCGAGGT－3′）為反向引物。最后進(jìn)行SYBR GREEN實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。該方法具有樣品所需量少、靈敏度高、檢測(cè)范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)［15－16］（圖6）。

4 miRNA對(duì)靶基因mRNA的切割位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)

4.1 3′PPM－RACE （poly （A）polymerase－mediated 3′rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)

通過(guò)miRNA對(duì)靶基因mRNA的識(shí)別剪切，剪切后產(chǎn)生1個(gè)5′剪切片段和1個(gè)3′剪切片段。其中，5′剪切片段包含5′帽子結(jié)構(gòu)和3′羥基基團(tuán)；3′剪切片段則包含5′磷酸基團(tuán)和3′polyA尾巴。與5′RLM－RACE不同的是3′PPM－RACE技術(shù)選取含有帽子結(jié)構(gòu)的5′剪切片段，在poly（A）聚合酶（PAP）的作用下添加1段polyA尾巴。隨后用特異 的 逆 轉(zhuǎn) 錄 引 物 dT30RT primer ［5′－ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd （T）30（A，G or C）（A，G，C，or T）－3′］合成cDNA。使用接頭的通用引物和基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)［17－18］（圖7A 路徑）。

圖6 莖環(huán)法檢測(cè)miRNA表達(dá)量原理（引自Chen et al［15］，2005）

圖7 3′PPM （A）和5′RLM－RACE （B）技術(shù)原理 （引自 Wang et al［20］，2012）

4.2 5′RLM－RACE （RNA ligase－mediated 5′rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)

在植物中，靶基因的切割是miRNA最主要的作用方式，其作用結(jié)果是靶基因mRNA被miRNARISC復(fù)合體在靶位點(diǎn)切斷。采用T4RNA連接酶介導(dǎo)的5′RLM－RACE方法可以檢測(cè)被切斷的靶基因mRNA，而其做法區(qū)別于常規(guī)5′RACE［18］。5′RLM－RACE先用T4RNA連接酶在被剪切后的mRNA的5′端加上1個(gè) RNA Adapter （5′－CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUA GAAA－3′），再將連有接頭的RNA進(jìn)行沉淀。接著用oligo d（T）18或隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將cDNA進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋后，然后用接頭上的2個(gè)特異引物和2個(gè)基因特異引物 （GSP1和GSP2）進(jìn)行 巢式 PCR 擴(kuò) 增。其中 RACE OUTER PRIMER 為5′－CGACTGGAGCACGAGGACACTGA－3′，RACE INNER PRIMER為5′－GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA－3′。然后回收凝膠產(chǎn)物，進(jìn)行純化后，連接在T載體中克隆、測(cè)序鑒定切割位點(diǎn)［17，20－25］。

被miRNA－RISC復(fù)合體切斷的靶基因mRNA有別于完整的mRNA，后者有5′帽子結(jié)構(gòu)，所以不能連接RNA接頭，在反轉(zhuǎn)錄后PCR中不能被擴(kuò)增。被切割的靶基因mRNA相對(duì)于隨機(jī)斷裂的mRNA，其切割位點(diǎn)是固定的，因此，在5′RLM－RACE結(jié)果中，沿mRNA序列隨機(jī)斷裂位點(diǎn)呈隨機(jī)分布，而在切割位點(diǎn)處呈現(xiàn)出異常高的克隆頻次。這種5′RLM－RACE方法在單個(gè)miRNA研究中已被廣泛應(yīng)用并被證明是有效的 （圖7B路徑）。

4.3 PARE （parallel analysis of RNA ends）技術(shù)

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，加之植物miRNA在調(diào)控靶基因的表達(dá)時(shí)通常具有與靶基因mRNA幾乎完全匹配的特點(diǎn)，2008年又出現(xiàn)了一種結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析和RACE驗(yàn)證三者優(yōu)勢(shì)的新的檢測(cè)方法，稱為PARE技術(shù) （parallel analysis of RNA ends），又稱為降解組測(cè)序技術(shù) （degradome sequencing）［26］。

植物中大部分miRNA與靶基因mRNA間完全或幾乎完全互補(bǔ)配對(duì)，并在互補(bǔ)位點(diǎn)的第10或11位核苷酸上發(fā)生切割作用以調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA對(duì)靶基因mRNA切割后產(chǎn)生1個(gè)5′片段和1個(gè)3′片段。其中，5′片段包含5′帽子結(jié)構(gòu)和3′羥基基團(tuán)；3′片段則包含5′磷酸基團(tuán)和3′polyA尾巴。在T4 RNA連接酶的作用下 RNA 接頭 RNA dapter （5′－GUUCAGAGUUCUACAGUCCGAC－3′）可與5′單磷酸RNA連接而與含有帽子結(jié)構(gòu)的5′剪切片段或其他缺少5′單磷酸基團(tuán)的RNA無(wú)法連接，這一點(diǎn)的原理同5′RLM－RACE一致。用oligo d （T）Primer（5′－CGAGCACAGAATTAATACGACT （21）V－3′）將連接有RNA Adapter的3′切割產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA加入通用前引物 （5′－GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC－3′）和后引物 （5′－CGAGCACAGAATTAATACGAC－3′）按以下程序擴(kuò)增6個(gè)循環(huán):94°C 30s，60°C 20s，72°C 3min。由于該RNA Adapter上存在1個(gè)限制性內(nèi)切酶Mme I識(shí)別位點(diǎn)，可識(shí)別位點(diǎn)下游20bp處進(jìn)行切割。Mme I進(jìn)行酶切反應(yīng)，隨后在T4DNA連接酶的作用下使酶切產(chǎn)物與雙鏈DNA adapter連接，其雙鏈DNA adapter的上鏈序列為5′－TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG－3′，下鏈序列5′－CAAGCAGAAGACGGCATACGANN－3′。使用 RNA 接頭的通用引物Forward Prime （5′－GGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC－3′）和DNA接頭的通用引物 Reverse Prime（5′－CAAGCAGAAGACGGCATACGA－3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后純化膠回收產(chǎn)物進(jìn)行深度測(cè)序［19，27－34］（圖8）。

圖8 PARE技術(shù)原理 （引自Thomson D W et al［26］，2011）

5 結(jié)語(yǔ)

自1993年Lee發(fā)現(xiàn)第一個(gè)miRNA，近年來(lái)miRNA的研究及其發(fā)展日益增多。研究表明，miRNA參與了大多數(shù)生物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境適應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)等生命活動(dòng)，但多數(shù)miRNA參與其中的具體分子機(jī)制尚未明了，仍有待研究。

因此，了解和掌握miRNA的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)技術(shù)，使它們?cè)诰唧w生命活動(dòng)過(guò)程中的表達(dá)活性可進(jìn)行差異性對(duì)比，有助于研究多數(shù)miRNA的高度保守性、時(shí)空特異性，可探究miRNA的相關(guān)功能?；谏鲜?種miRNA的定量檢測(cè)技術(shù)，將其不同方法的優(yōu)點(diǎn)及區(qū)別簡(jiǎn)述如下:PolyA聚合酶加尾法特異性極其靈敏性相對(duì)較一般，末端的甲基可能影響Poly（A）的添加，但操作簡(jiǎn)單；引物延伸法特異性強(qiáng)，可區(qū)分同一基因家族成員，但操作過(guò)程繁瑣；Multiplexed RT法特異性和靈敏性好，一次操作便可得到多個(gè)miRNA的信息，但其引物設(shè)計(jì)過(guò)程復(fù)雜；miR－Q法對(duì)豐度的要求多靈敏性較差，引物設(shè)計(jì)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單；莖環(huán)法為近年來(lái)常用的首選方法，其操作費(fèi)用低廉，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)樣品的豐度要求低，靈敏性很好，引物設(shè)計(jì)過(guò)程簡(jiǎn)單。

根據(jù)所需研究的miRNA結(jié)合生物信息學(xué)，預(yù)測(cè)其靶基因mRNA，通過(guò)介紹的3種靶基因的剪切位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。3′PPM－RACE技術(shù)和5′RLM－RACE技術(shù)是基于RACE技術(shù)，但又不同于常規(guī)RACE技術(shù)的檢測(cè)靶基因切割位點(diǎn)的方法，其在操作驗(yàn)證中已被證明有效，相關(guān)試劑盒的開(kāi)發(fā)也使實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便高效；PARE技術(shù)在近年來(lái)測(cè)序技術(shù)的成熟下，逐漸被越來(lái)越多地使用，可以預(yù)測(cè)到同一miRNA的不同靶基因，操作過(guò)程稍微繁瑣，但可得到廣泛的信息。

［1］Jover－Gil S，Candela H，Ponce M R.Plant microRNAs and development［J］.Int J Dev Biol，2005，49:733－744.

［2］Tomari Y，Zamore P D.MicroRNA biogenesis:drosha can’t cut it without a partner［J］.Curr Biol，2005，15:61－64.

［3］Yu B，Yang Z，Li J，et al.Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis［J］.Science，2005，307:932－935.

［4］Baumberger N，Baulcombe D C.Arabidopsis ARGONAUTE1is an RNA slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:11928－11933.

［5］Chen X.MicroRNA biogenesis and function in plants ［J］.FEBS Lett，2005，579:5923－5931.

［6］Lee R C，F(xiàn)einbaum R L，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin－4encodes small RNAs with anti－sense complementarity to lin－14 ［J］.Cell，1993，75:843－854.

［7］陳新，曾長(zhǎng)英，盧誠(chéng).基于PCR技術(shù)的miRNA定量檢測(cè)方法 ［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30（11）:88－93.

［8］景花，宋沁馨，周?chē)?guó)華.MicroRNA定量檢測(cè)方法的研究進(jìn)展遺傳 ［J］.遺傳，2010，32（1）:31－40.

［9］Shi R，Chiang V L.Facile means for quantifying microRNA expression by real time PCR ［J］.Biotechniques，2005，39:519－525.

［10］Zeng C Y，Wang W Q，Zheng Y，et al.Conservation and divergence of microRNAs and their functions in Euphorbiaceous plants［J］.Nucleic Acids Research，2009:981－995.

［11］Petersen M，Wengel J.LNA:a versatile tool for therapeutics and genomics［J］.Biotechnology，2003，2:74－81.

［12］Raymond C K，Roberts B S，Garrett－Engele P，et al.Simple，quantitative primer－extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short－interfering RNAs ［J］.RNA，2005，11:1737－1744.

［13］Wang X W.A PCR－based platform for microRNA expressionp rofiling studies［J］.RNA，2009，15:716－723.

［14］Sharbati－Tehrani S，Kutz－Lohroff B，Bergbauer R，et al.miR－Q:a novel quantitative RT－PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample［J］.BMC Molecular Biology，2008，9:34－46.

［15］Chen C，Ridzon D A，Broomer A J，et a1.Rea1－time quantification of microRNAS by Stemloop RT－PCR ［J］.Nuc1eic Acids Res，2005，33:179－187.

［16］Yang H P，Schmuke J J，F(xiàn)lagg L M，et al.A novel real time polymerase chain reaction method for high throughput quantification of small regulatory RNAs［J］.Plant Biotech J，2009，7:621－630.

［17］Song C，Yu M，Han J，et al.Validation and characterization of citrus sinensis microRNAs and their target genes［J］.BMC Research Notes，2012，5:235－243.

［18］Shangguan L，Song C，Han J，et al.Characterization of regulatory mechanism of Poncirus trifoliate microRNAs on their target genes with an integrated strategy of newly developed PPM－RACE and RLM－RACE ［J］.Gene，2014，535:42－52.

［19］郭曉琴，孫紅正.microRNA靶基因檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 ［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（4）:11－13，18.

［20］Wang J，Yang X，Xu H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea ［J］.Gene，2012，2:300－308.

［21］Sun X，Korir N K，Han J，et al.Characterization of grapevine microRNA and its target genes ［J］.Mol Biol Rep，2012，39:9463－9472.

［22］Wu G，Poethig R S.Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156and its target SPL3 ［J］.Development，2006，133:3539－3547.

［23］Maile R B，Kronengold J，Gazula V R，et al.Amino－termini isoforms of the Slack K＋channel，regulated by alternative promoters，differentially modulate rhythmic firing and adaptation ［J］.J Physiol，2008，5161－5179.

［24］Davis M E，Zuckerman J E，Hang C，et al.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles［J］.Nature，2010，464:1067－1071.

［25］Coutts R H A，Livieratos I C.A Rapid Method for Sequencing the 5′and 3′Termini of Double－Stranded RNA Viral Templates using RLM－RACE ［J］.J Phytopathology，2003，151:525－527.

［26］Thomson D W，Bracken C P，Gregory J.Survey and summary experimental strategies for microRNA target identification ［J］.Nucleic Acids Research，2011，39:6845－6853.

［27］Zhou M，Gu L，Li P，et al.Degradome sequencing reveals endogenous small RNA targets in rice（Oryza sativa L.ssp.indica）［J］.Front Biol，2010，5:67－90.

［28］董淼，黃越，陳文鐸，等.降解組測(cè)序技術(shù)在植物miRNA研究中的應(yīng)用 ［J］.植物學(xué)報(bào)，2013，48（3）:344－353.

［29］German M A，Pillay M，Jeong D H，et al.Global identification of microRNA target RNA pairs by parallel analysis of RNA ends［J］.Nat Biotechol，2007，26:941－946.

［30］Li Y F，Zheng Y，Addo－Quaye C，et al.Transcriptomewide identification of microRNA targets in rice ［J］.Plant J，2010，62:742－759.

［31］Zhang J Z，Ai X Y，Guo W W，et al.Identification of miRNAs and their target genes uing deep sequenceing and degradome analysis in trifoliate orange（Poncirus trifoliate L.Raf）［J］.Mol Biotechnol，2012，51:44－57.

［32］Xu M Y，Dong Y，Zhang Q X，et al.Identification of miRNAs and their targets fromBrassica napus by highthrought sequengcing and degradome analysis ［J］.BMC Genomics，2012，13:421－428.

［33］Shamimuzzaman M，Vodkin L.Identification of soybean seed developmental stage specific and tissue specific miRNA targets by degradome sequencing ［J］.BMC Genomics，2012，13:310－318.

［34］Mao W，Li Z，Xia X，et al.A combined approach of high throughput sequencing and degradome analysis reveals tissue specific expression of microRNAs and targets in cucumber［J］.PLoS One，2012，7:330－340.