陳艷榮

（黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041）

王繼文

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 雅安 625014）

線粒體細胞色素b（Cyt b）是構(gòu)成線粒體細胞色素bc1復(fù)合體的蛋白質(zhì)之一，也是其中唯一由線粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)，它轉(zhuǎn)移2種不同形式的血紅素:高電位式 （bH）和低電位式 （bL）。這些血紅素分別位于線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)和外側(cè)，形成了輔酶Q的2個氧化還原位點 （Q0、Q1）間的跨膜電子循環(huán)［1－3］。目前對于Cyt b在電子傳遞鏈中的復(fù)雜功能仍不盡清楚［3］。Cyt b是一個橫貫?zāi)蓚?cè)的極端疏水性的蛋白，與線粒體內(nèi)膜結(jié)合極為緊密，很難將其單獨分離［4］。由于具有較強的疏水性，不易結(jié)晶，采用常規(guī)的晶體學方法研究其結(jié)構(gòu)和功能效率較低［5］。同源建模 （比較建模）是目前唯一能夠從蛋白質(zhì)的氨基酸序列 （目標序列）出發(fā)，建立3D模型的計算方法［6］。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的序列更保守，如果2個蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列有50%相同，那么約有90%的α碳原子的位置偏差不超過3%。這是同源模型化方法在結(jié)構(gòu)預(yù)測方面成功的保證［7－8］。

本研究通過利用結(jié)構(gòu)已知的Cyt b家族成員 （模板）預(yù)測新序列的結(jié)構(gòu)，建立序列與相應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能間的聯(lián)系，從而用較低成本和較短時間預(yù)測出家鵝 （Anser domestica）Cyt b蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究測定了中國家鵝和歐洲鵝 （Anser domestica）（15個中國家鵝品種、2個歐洲家鵝品種共17個品種）44個體的Cyt b基因全序列 （GenBank登錄號:AY427816），使用軟件DNASTAR將其翻譯成氨基酸序列，在GenBank中Blast并下載其他物種Cyt b氨基酸序列，合并通過肉眼和程序CLUSTAL W進行多重排序，推導(dǎo)出氨基酸序列。

1.2 同源建模

選用SWISS－MODEL蛋白質(zhì)比較建模服務(wù)器進行 Cyt b的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 （http:／／swissmodel.expasy.org）選擇簡捷模式 （First approachmode）直接通過web界面提交所測氨基酸序列，服務(wù)器會完全自動地為目標序列建立模型；若一條模板與提交的目標序列相似度大于25%，建模程序就會自動開始運行。

利用DeepView軟件、Antheprot＿3D＿viewer軟件并搜索PDF和PROISTE數(shù)據(jù)庫，對所預(yù)測的Cyt b高級結(jié)構(gòu)進行觀察和分析，定位活性位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)測結(jié)果

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫搜索和同源性查找，ID為1bccC結(jié)構(gòu)被作為建模的模板，它與目標序列具有90%的高序列同源性，三級結(jié)構(gòu)較為相近，這為同源建模提供了可能。模建結(jié)果如圖1。

圖1 同源建模預(yù)測的Cyt b三級結(jié)構(gòu)

預(yù)測結(jié)構(gòu)包含8個較大的α螺旋，應(yīng)該就是Cyt b蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，它們被4個長的松散結(jié)構(gòu)（LOOP）和3個短的易變區(qū)連接在一起，另外還有4個較小的螺旋，2個小的β－折疊片層。ANOLEA被用來評估模型的裝配質(zhì)量，計算多肽鏈能量，評測蛋白分子的每個原子 “非局部環(huán)境 （NLE）；VERIFY3D使用三維輪廓評估蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，依據(jù)三維結(jié)構(gòu)演算還原被測序列，計算氨基酸序列 （1D）和三維結(jié)構(gòu) （3D）間的相容性。利用以上2種方法評估所得預(yù)測結(jié)構(gòu)，得出符合評估有利條件的氨基酸殘基占全部殘基的90%，說明建模的結(jié)構(gòu)基本合理。

2.2 Ramachamdran圖和分子表面

Ramachamdran圖顯示主鏈98.1%的Ψ、Φ角落在核心區(qū)和允許區(qū)，即藍線封閉區(qū)，說明模建的結(jié)構(gòu)合理。從圖2可以看出，落在 （－60°，－60°）區(qū)域中落入殘基密度最大，這是反映右手α螺旋的區(qū)域，說明Cyt b蛋白結(jié)構(gòu)是以α螺旋為主，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。

通過分子表面的有關(guān)計算得知，該分子面積為17870?2，體積為49028?3；含有2個洞穴 （cavity），一個較大，面積為184?2，體積為168?3（圖3紅線區(qū)），另一個較小，面積和體積分別為42?2和20?3（圖3綠線區(qū)），一般來說，分子表面的洞穴很可能是底物結(jié)合的部位，附近的氨基酸極有可能為活性位點。

圖2 拉氏構(gòu)象圖

圖3 分子表面的洞穴

2.3 靜電勢預(yù)測

從靜電勢分布來看，Cyt b分子表面靜電勢比內(nèi)部高；存在2處較強的正電勢區(qū)和兩處相對較弱的負電勢區(qū)，正電勢含堿性氨基酸殘基的數(shù)量較大 （圖4）。ALA2～HIS9等殘基形成的松散區(qū)呈正電勢，另一處正電勢區(qū)范圍較大，預(yù)測的2個洞穴都位于正電勢區(qū)，即該區(qū)的靜電勢有一部分可能來自于活性位點周圍的蛋白質(zhì)原子，可能的活性殘基具有大的電荷密度，故有較強的結(jié)合受體或與其他蛋白相互作用的能力，值得注意的是，在SER28、ILE29、SER206、ASN207、ASN208等殘基處存在靜電勢的極值，ALA59、PHE63、ASP 64和SER65等殘基也有此現(xiàn)象，推斷很可能與特定的電子傳遞功能有關(guān)。

圖4 靜電勢預(yù)測

2.4 保守區(qū)的查找

利用NCBI的Blast進行同源性查找，可獲得序列的保守Domain（CD）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cyt b蛋白有2個結(jié)構(gòu)域，分別為Cyt B＿N和CytB＿C，前者包含序列N端10～207位的氨基酸殘基，搜索到3個活性部位:（1）血紅素bH結(jié)合部位，包括31、34～35、37、38、90、94、97、98、100、112、113、116、117、119、120、193、197、200、205和206等多個位點殘基； （2）血紅素bL結(jié)合部位，包括441、44、45、48、49、51、52、55、66、80、83、84、87、126、127、130、131、133、134、182、183、186等位點殘基； （3）Qi結(jié)合部位，包括121、124、125、128、129、142、145、146、150、178和181位點殘基。后者包含序列N端208～355位的殘基；2個活性部位:（1）Qi結(jié)合部位，包括268、270、271、274、277、278和294位點的氨基酸；（2）Qo結(jié)合部位，包括220和228位點殘基。

目標序列與模板1bccC序列同源性達到90%，將兩者的結(jié)構(gòu)疊印進行比較 （圖5），紅色的為模板結(jié)構(gòu)，白色的為Cyt b預(yù)測結(jié)構(gòu)；Cyt b與模板1bccC之間拓撲等價殘基的Cα原子距離均方根差（RMS）為0.08?，從圖5可看出2個血紅素結(jié)合位點 （箭頭處）。

另外，在PROFILESCAN服務(wù)器搜索PROSITE庫，對蛋白質(zhì)中的相似結(jié)構(gòu)位點、功能域進行搜索，可得到一系列具有相似結(jié)構(gòu)位點或功能域的已知的蛋白質(zhì)序列 （表1）。

由表1可知，該氨基酸序列中包含6個功能位點。但是，除后2個位點外，其他的一些結(jié)構(gòu)和功能位點由于序列較短，更可能是隨機匹配的結(jié)果。PS00197與NCBI庫搜索到的血紅素bL位點有部分重合，而PS000193則NCBI中搜索的Qo結(jié)合位點亦有重疊。

3 討論

預(yù)測結(jié)果顯示，Cyt b蛋白高級結(jié)構(gòu)是α螺旋為主的。這和目前大部分研究結(jié)果一致。Kubota等［9］研究了牛心線粒體的Cyt b晶體結(jié)構(gòu)，認為Cyt b蛋白由2個β－折疊，13個α螺旋，其中的9個螺旋組成Cyt b的跨膜結(jié)構(gòu)；Gao等［10］2003年修正了這個模型，把9個跨膜螺旋減為8個，并把推斷的兩性螺旋定位在N末端。Zhang等［11］研究了雞的Cyt bc1復(fù)合物，共確定了12個跨膜螺旋，把其中的8個分配給了Cyt b蛋白，現(xiàn)在大部分研究都支持這一模型。根據(jù)靜電勢分析結(jié)果，由于正電勢區(qū)堿性氨基酸殘基的數(shù)量較大，導(dǎo)致了具有較強的正電性，正電荷越多，越不利于分配在水相中，形成了較明顯的疏水區(qū)［12］。本研究所預(yù)測Cyt b結(jié)構(gòu)中，8條長的螺旋幾乎都有部分區(qū)域被分配在正電勢區(qū)，可以確定其跨膜結(jié)構(gòu)特征。

圖5 Cyt b與1bccC結(jié)構(gòu)疊印圖

表1 ScanProsite搜索得到的結(jié)構(gòu)和功能位點

細胞色素bc1復(fù)合物由Cyt b、Cytb C1和鐵硫蛋白 （ISP）組成，主要作用是將電子從輔酶QH2（CoQH2）轉(zhuǎn)移到Cyt c，具體步驟:CoQH2（來自復(fù)合物1）先與Cyt b特殊部位結(jié)合，將1個電子轉(zhuǎn)移給ISP，并將它的2個質(zhì)子釋放到膜間空間，產(chǎn)生半醌離子 （CoQ－），ISP將其獲得的電子傳遞給Cyt C，而CoQ－則把它保留的1個電子轉(zhuǎn)移給Cyt b上的血紅素，產(chǎn)生完全氧化的CoQ，CoQ從原來的結(jié)合部位脫落，轉(zhuǎn)移到Cyt b的另一結(jié)合部位，在該處接受被Cyt b血紅素還原的電子，再轉(zhuǎn)變成CoQ－，完成在復(fù)合物的電子傳遞。Cyt b為完成自身功能必要涉及到幾個結(jié)合位點:即CoQH2、CoQ等不同形式出現(xiàn)的輔酶Q的結(jié)合位點 （Qo和Qi），氧化電勢的血紅素、還原電勢的血紅素結(jié)合位點（bH 和bL）［13－14］。

抗菌素A能結(jié)合到細胞色素BH附近，阻止電子從BH向輔酶Q傳遞，這就是證實Qi部位的存在。Esposti等［15］研究得出:Qi結(jié)合部位在Cyt b的bH附近，位于1個由血紅素、3條跨膜螺旋和1條兩性表面螺旋組成的洞穴內(nèi)，經(jīng)由保守性組氨酸 （或組氨酸附近）與線粒體基質(zhì)發(fā)生可能質(zhì)子性聯(lián)系。本研究目標序列與模板序列的對比中所定位的Qi結(jié)合位點沒有那么復(fù)雜，正確與否還待進一步研究。

Cyt b蛋白與血紅素是以非共價鍵結(jié)合的。Xia等［16］、Iwata等［17］研究了牛心線粒體Cyt bc1復(fù)合物，認為血紅素被填充在由位于其周圍的4個螺旋捆束成的空間內(nèi)，這種結(jié)構(gòu)可以更好地防止血紅素被溶解，也更有利于血紅素附近的基團和4個精氨酸形成更強烈的靜電互作。本研究中搜索RPOSITE庫時血紅素配基信號，結(jié)合目標序列與模板序列比對，并將預(yù)測結(jié)構(gòu)與模板結(jié)構(gòu)疊印，粗略確定了bH和bL位點；但結(jié)合靜電勢預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這2個位點與表觀靜電勢分布似乎關(guān)聯(lián)不大，幾處電勢較強的位置似乎更和Cyt bc1復(fù)合物的其他亞基結(jié)合有關(guān)；關(guān)于活性位點定位及精細位置還待以后進一步研究。

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