徐鏡波，李鑄衡，李 爽

（東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，濕地生態(tài)與植被恢復(fù)國(guó)家環(huán)保部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117）

水生生物的急性和慢性致死試驗(yàn)具有相對(duì)廉價(jià)和容易操作、可以很快地獲得數(shù)據(jù)的優(yōu)點(diǎn)，因而在過(guò)去的幾十年里，這些試驗(yàn)構(gòu)成了化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)價(jià)、環(huán)境管理的基石，在確定點(diǎn)源污染效應(yīng)和比較物質(zhì)毒性方面起到了很大的作用.然而，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于受試化合物的暴露研究，通常是受試生物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中被暴露在持續(xù)恒定的受試化合物濃度中，這種穩(wěn)定的暴露條件不可能完全切合野生物種的現(xiàn)實(shí)暴露狀態(tài)［1］.因此，由上述這種廣泛應(yīng)用的經(jīng)典方法——“持續(xù)恒定濃度暴露”獲得的半致死或半效應(yīng)劑量／濃度，在某種程度上也具有許多局限［2－3］.

水生生物總是暴露于各種環(huán)境污染物隨時(shí)間變化的波動(dòng)起伏中.表面水的流失和相關(guān)的水解稀釋、擴(kuò)散激流的沉淀析出，以及環(huán)境污染物活性的降解都能夠產(chǎn)生脈沖式暴露.因此一個(gè)簡(jiǎn)單的時(shí)間－不變的暴露模式不太可能代表水生生物在自然生境中所遭遇的不斷波動(dòng)變化的環(huán)境濃度.準(zhǔn)確地度量暴露時(shí)間的效應(yīng)對(duì)于評(píng)價(jià)污染物生態(tài)毒理方面的結(jié)果是非常重要的.為了達(dá)到這一目的，本文利用時(shí)間－反應(yīng)法（time－response approach）為劑量／濃度－反應(yīng)方法做補(bǔ)充，探討污染物脈沖式暴露的水生態(tài)毒理效應(yīng).在時(shí)間－反應(yīng)方法中，測(cè)量的是死亡時(shí)間，從每個(gè)暴露濃度梯度中獲得更多的數(shù)據(jù)，因此提高了統(tǒng)計(jì)效能.雖然有這么多明顯的優(yōu)點(diǎn)，生態(tài)毒理學(xué)者目前仍然未對(duì)時(shí)間－反應(yīng)方法充分加以利用［4］.本文基于時(shí)間－反應(yīng)法，重點(diǎn)闡明、評(píng)估了水生生物污染暴露的半數(shù)死亡時(shí)間（median lethal time，LT50，T50）的模型基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)擬合的方法.

1 時(shí)間－反應(yīng)法

1.1 死亡時(shí)間

為了準(zhǔn)確地度量暴露的時(shí)間效應(yīng)，時(shí)間－反應(yīng)方法測(cè)量的是死亡時(shí)間（TTD，time to death），即從每個(gè)污染暴露的實(shí)驗(yàn)中能夠獲得更多的數(shù)據(jù)，因此提高了統(tǒng)計(jì)效能，對(duì)于評(píng)價(jià)污染物生態(tài)毒理效應(yīng)也是極其重要的.例如，在盛有10條魚(yú)的暴露容器中，可以得到10條魚(yú)的10個(gè)死亡時(shí)間——TTD值，而不只是一個(gè)比例.

存活時(shí)間法觀(guān)察的終點(diǎn)——死亡時(shí)間是與每個(gè)個(gè)體相關(guān)的，是把效應(yīng)作為暴露時(shí)間和濃度的共同函數(shù)來(lái)加以預(yù)測(cè).圖1顯示了發(fā)生在6個(gè)不同濃度下的理想化的死亡比例時(shí)間進(jìn)程［4］.如果圖1中只用96h的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，LC50的計(jì)算僅僅用了5個(gè)點(diǎn)；如果觀(guān)察記錄個(gè)體的死亡時(shí)間數(shù)據(jù)而不僅僅是死亡比例，則可以產(chǎn)生更多的數(shù)據(jù)點(diǎn)，提高了統(tǒng)計(jì)效能［4］.

1.2 時(shí)間－反應(yīng)數(shù)據(jù)的擬合

基于死亡時(shí)間概念和時(shí)間－反應(yīng)的相關(guān)模式，建立分析時(shí)間－反應(yīng)數(shù)據(jù)的方法.觀(guān)察記錄的個(gè)體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以被直接運(yùn)用或者經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換.通常，轉(zhuǎn)換的目的是使時(shí)間和反應(yīng)之間的關(guān)系呈線(xiàn)性［4］.在生物毒性試驗(yàn)中，測(cè)量數(shù)據(jù)或經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換的測(cè)量數(shù)據(jù)，即時(shí)間以及效應(yīng)的測(cè)量數(shù)據(jù)都可以用于時(shí)間－反應(yīng)數(shù)據(jù)的分析.

圖1 死亡率與死亡時(shí)間的關(guān)系

半致死時(shí)間LT50值及相應(yīng)置信區(qū)間是由時(shí)間－反應(yīng)模型得出的最常用的統(tǒng)計(jì)量.LT50是在預(yù)定的濃度下導(dǎo)致50%被暴露個(gè)體死亡的時(shí)間.概率單位（Probit）轉(zhuǎn)換來(lái)自于正態(tài)等差（normal equivalent deviation，NED），即以距正態(tài)曲線(xiàn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)表示的死亡比例.首先，觀(guān)察記錄在一系列暴露時(shí)間下被暴露個(gè)體反應(yīng)的比例.以反應(yīng)比例的概率單位t值對(duì)暴露時(shí)間的對(duì)數(shù)作圖，可以生成一條如圖2所示的直線(xiàn)［4］.

圖2 死亡率、概率單位與時(shí)間的關(guān)系

LT50值及相應(yīng)置信區(qū)間估計(jì)的步驟如下：

首先，觀(guān)察記錄個(gè)體的死亡時(shí)間數(shù)，列出在一系列暴露時(shí)間下被暴露個(gè)體反應(yīng)的比例.以反應(yīng)比例的概率單位值對(duì)暴露時(shí)間的對(duì)數(shù)作圖，以生成一條如圖2的直線(xiàn).用目測(cè)法在這些數(shù)據(jù)上畫(huà)一條直線(xiàn)，導(dǎo)致50%死亡率的概率單位值對(duì)應(yīng)的時(shí)間就是估計(jì)的LT50.

第二，計(jì)算95%置信區(qū)間.和劑量－反應(yīng)數(shù)據(jù)一樣，死亡隨時(shí)間的分布可以從圖2中的一系列數(shù)據(jù)選擇.估計(jì)LT50的方法是一種半圖解法［4］.如圖3所示，線(xiàn)上對(duì)應(yīng)于16%，50%和84%死亡率的點(diǎn)用來(lái)估計(jì)LT50及其95%置信區(qū)間.相應(yīng)于P＝0.50的時(shí)間對(duì)數(shù)值的反對(duì)數(shù)就是 LT50.斜率因子（S）由16%（LT16），50%（LT50）和84%（LT84）死亡率的相應(yīng)時(shí)間計(jì)算得出［4］：

圖3 時(shí)間－反應(yīng)關(guān)系

式中：S為斜率因子；a為16%死亡率的時(shí)間（LT16值）；b為50%死亡率的時(shí)間（LT50值）；c為84%死亡率的時(shí)間（LT84）.

用從這條線(xiàn)得出的斜率因子來(lái)計(jì)算95%置信區(qū)間.式中，LT16，LT50和LT84分別是16%，50%和84%暴露個(gè)體死亡時(shí)對(duì)應(yīng)的時(shí)間.然后計(jì)算f值（用S以及處理中在LT16和LT84之間被暴露的動(dòng)物總數(shù)N求得），估計(jì)LT50值的95%置信上下限：

2 水生生物污染暴露的半數(shù)死亡時(shí)間

受試化合物為第二松花江典型污染物鄰二硝基苯（1，2－DNT），污染暴露的受試水生生物為敏感鯉魚(yú)幼魚(yú).根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及LC50值結(jié)果，被測(cè)物濃度梯度設(shè)置為5.6，4.2，3.2mg／L，基于時(shí)間－反應(yīng)法評(píng)估的水生生物污染暴露半數(shù)死亡時(shí)間（LT50）的測(cè)定結(jié)果如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

LT50及相應(yīng)置信區(qū)間估計(jì)的步驟如下：

（1）將死亡時(shí)間轉(zhuǎn)換為死亡時(shí)間的對(duì)數(shù)值（見(jiàn)表1）.

（2）利用概率單位換算表（見(jiàn)表2），將死亡百分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換成概率單位.

（3）根據(jù)概率單位作圖法，將死亡時(shí)間對(duì)數(shù)和死亡百分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換成的概率單位作圖，順著繪出點(diǎn)分布趨勢(shì)作一條直線(xiàn).將表1中5.6，4.2，3.2mg／L濃度組的死亡時(shí)間對(duì)數(shù)（x）和死亡百分?jǐn)?shù)概率單位（y）作圖；或者進(jìn)行兩者的直線(xiàn)回歸方程分析.

（4）如圖2（右圖）、圖3，從縱軸的概率單位為5處作一平行于橫軸的平行線(xiàn)，與所作直線(xiàn)必有相交之“點(diǎn)”，再自這“點(diǎn)”作橫軸的垂線(xiàn)，交橫軸之點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的值即為L(zhǎng)T50的對(duì)數(shù).最后，查反對(duì)數(shù)，得到5.6，4.2，3.2mg／L質(zhì)量濃度下的LT50值分別13.10，39.20，110.10min（見(jiàn)表1）.

（5）同時(shí)，求直線(xiàn)的回歸方程，也就是時(shí)間與反應(yīng)關(guān)系的回歸方程.依據(jù)SPSS17.0得到死亡時(shí)間對(duì)數(shù)（x）和死亡百分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換成的概率單位（y）的直線(xiàn)回歸方程和LT50值：

直線(xiàn)回歸方法獲得的5.6，4.2，3.2mg／L濃度下的LT50值分別13.46，39.77，112.26min，與表1中用概率單位作圖法獲得的三個(gè)濃度下的LT50值相同.

（6）求LT50的置信限.按式（1）和（2），求斜率因子（S），f，得到LT50的置信限：

5.6mg／L濃度組LT50的置信限：10.68～16.96min.

4.2mg／L濃度組LT50的置信限：32.33～48.92min.

3.2mg／L濃度組LT50的置信限：80.40～129.68min.

表2 概率單位換算表

3 結(jié)語(yǔ)

由于現(xiàn)今標(biāo)準(zhǔn)恒定暴露的毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)量的局限，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室毒性實(shí)驗(yàn)迄今為止幾乎不能特定地完成現(xiàn)實(shí)環(huán)境中時(shí)間－改變的暴露效應(yīng)評(píng)價(jià).本文基于時(shí)間－反應(yīng)法，介紹了鯉魚(yú)幼魚(yú)暴露于1，2－DNT的LT50數(shù)據(jù)擬合與處理方法.期望隨著與傳統(tǒng)劑量或濃度－反應(yīng)試驗(yàn)方法（LD50／LC50或ED50／EC50）能有效結(jié)合，進(jìn)一步豐富生態(tài)毒理學(xué)的研究?jī)?nèi)容.

［1］HYNDMAN K M，BIALES A，BARTELL S E，et al.Assessing the effects of exposure timing on biomarker expression using 17β－estradiol［J］.Aquatic Toxicology，2010，96：264－272.

［2］DIAMOND J M，KLAINE S J，BUTCHER J B.Implications of pulsed chemical exposures for aquatic life criteria and wastewater permit limits［J］.Environmental Science and Technology，2006，40：5132－5138.

［3］ZHAO Y，NEWMAN M C.Shortcomings of the laboratory－derived median lethal concentration for predicting mortality in field populations：exposure duration and latent mortality［J］.Environmental Toxicology Chemistry，2004，24：2147－2153.

［4］NEWMAN M C，UNGER M A.Fundamentals of ecotoxicology［M］.USA：Lewis Publishers，2003.