韓海斌，周曉榕，龐保平，常 靜

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

0 引言

亞洲小車蝗Oedaleus asiaticus（Bienko）是我國(guó)北方蝗蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種［1］，同時(shí)也是內(nèi)蒙古草原蝗蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種.亞洲小車蝗在內(nèi)蒙古的主要分布地區(qū)為錫林郭勒盟中西部至鄂爾多斯市東部的典型草原和荒漠草原地區(qū)，發(fā)生數(shù)量是所有蝗蟲(chóng)的50%～60%，嚴(yán)重的時(shí)候甚至可以達(dá)到90%以上，是草原上最嚴(yán)重的成災(zāi)蝗蟲(chóng)［2］.亞洲小車蝗發(fā)生為害早、且發(fā)生數(shù)量大的特點(diǎn)對(duì)受害作物危害嚴(yán)重，可導(dǎo)致受害作物減少50%以上的產(chǎn)量，甚至顆粒無(wú)收［3］.亞洲小車蝗對(duì)草原的危害更為嚴(yán)重，可破壞草原的自然生態(tài)平衡，使草場(chǎng)退化、沙化的速度加快，目前，已經(jīng)被認(rèn)定為草原退化的指示災(zāi)害種群［4］.因此，人們對(duì)亞洲小車蝗的遺傳多樣性進(jìn)行了大量研究［5－12］.

核糖體DNA（rDNA）是目前廣泛使用的細(xì)胞核DNA分子標(biāo)記，其編碼區(qū)的序列高度保守，間隔區(qū)的進(jìn)化速度大約與物種形成的進(jìn)程相仿［13－15］.rDNA中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA－ITS）序列的進(jìn)化速率較快，可以提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)［16］.前人已經(jīng)對(duì)許多物種的ITS序列做過(guò)研究［17］.王莉萍等對(duì)美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard不同地理種群的ITS1序列進(jìn)行了分析研究［16］；李正西和沈佐銳（2002）對(duì)松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogramma dendrolimi Matsumura的不同地理種群的ITS2序列進(jìn)行了研究分析［18］，探討了它們之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系.

本文對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)15個(gè)地點(diǎn)亞洲小車蝗的一段rDNA序列進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序和比較分析.希望從分子水平闡述同種蝗蟲(chóng)不同自然種群遺傳分化的機(jī)制，為其利用與綜合防治提供遺傳學(xué)方面的依據(jù)，從而為重災(zāi)蝗區(qū)蝗蟲(chóng)的防治工作提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 蝗蟲(chóng)樣本

本實(shí)驗(yàn)所用的亞洲小車蝗15個(gè)不同地點(diǎn)的樣本均為內(nèi)蒙古的自然種群（見(jiàn)表1），選取成蟲(chóng)個(gè)體進(jìn)行捕捉，然后用養(yǎng)蟲(chóng)籠活體帶回實(shí)驗(yàn)室中，用液氮速凍處理后放入－40℃的冰箱中保存.每個(gè)地理種群取5只蝗蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)序.

表1 亞洲小車蝗采集信息

1.2 蝗蟲(chóng)基因組DNA提取

取亞洲小車蝗后足股節(jié)（＜50g），研磨成粉狀后放入離心管中備用.使用天根dp304動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒對(duì)研磨成粉的樣本進(jìn)行DNA的提取，放入－40℃冰箱中備用.

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，其中2μL模板DNA，5μL 10×PCR Buffer，4μL的dNTP mix，2μL引物（10μmol／L），0.6μL TaKaRa Taq（5U／μL）（大連寶生物工程有限公司），最后用ddH2O補(bǔ)至50μL.

引物序列參考文獻(xiàn)［15］，由上海生工生物工程股份有限公司合成（見(jiàn)表2）.

表2 引物序列

PCR反應(yīng)用BIO－RAD PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性1min—55℃退火1min—72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存.

通過(guò)ADVANCE水平電泳儀，選用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè).

1.4 產(chǎn)物序列測(cè)定及序列分析

委托上海生工生物工程股份有限公司對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序.序列測(cè)定的結(jié)果與GenBank中已知的蝗蟲(chóng)：中華稻蝗Oxya chinensis formosana（登錄號(hào)為F385193.1），Chorthippus parallelus（登錄號(hào)為AY585651.1），小稻蝗Oxya hyla intricata（登錄號(hào)為 AF385196.1）、日本稻蝗Oxyajaponica japonica（登錄號(hào)為AF385194.1），臺(tái)灣小稻蝗Oxyapodisma（登錄號(hào)為AF385195.1）的rDNA序列進(jìn)行比對(duì).用Clustal X軟件對(duì)rDNA序列進(jìn)行測(cè)定；用MEGA 4.0軟件［19］對(duì)序列特征和遺傳距離進(jìn)行計(jì)算；使用DNASP 5.10.1［20］和Excel軟件計(jì)算單倍型多樣性（Hd）、種群遺傳分化系數(shù)（FST）、基因流（Nm）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）；采用Distance軟件計(jì)算地理距離；使用TFPGA進(jìn)行Mantel檢測(cè)；使用TCS對(duì)單倍型進(jìn)行分析并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖［21］.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列堿基組成分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)與GenBank中已知蝗蟲(chóng)序列的比較、剪切得到部分5.8S、全部ITS2和部分28S共288bp的rDNA序列.測(cè)試的15個(gè)種群的75個(gè)個(gè)體序列中，共有19個(gè)變異位點(diǎn)，其中包括16個(gè)堿基的替換（5個(gè)轉(zhuǎn)換和11個(gè)顛換）和3個(gè)堿基插入，占所測(cè)序列的6.60%；19個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中包括6個(gè)單變異多態(tài)性位點(diǎn)和13個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn).序列中T、A、C和G堿基平均含量分別為19.9%，27.6%，19.3%和33.2%，G＋C（60.8%）含量高于A＋T（39.2%）含量，與已知GenBank中5種蝗蟲(chóng)的對(duì)比序列堿基組成特點(diǎn)基本一致（平均堿基含量G＋C為63.8%，A＋T為36.2%）.

2.2 亞洲小車蝗種群內(nèi)遺傳多樣性分析

15個(gè)亞洲小車蝗種群的遺傳多樣性指數(shù)見(jiàn)表3.結(jié)果表明，15個(gè)種群的單倍型多樣性（Hd）在0.000～0.800之間，四子王旗和烏拉特中旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群最低；平均核苷酸差異數(shù)（K）在0.000～8.000之間，其中正鑲白旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群最低；核苷酸多樣性（Pi）在0.0000～0.0280之間，正鑲白旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群最低.說(shuō)明在察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群中沒(méi)有基因變異發(fā)生，四子王旗和烏拉特中旗種群變異產(chǎn)生的單倍型最多，正鑲白旗種群發(fā)生的變異位點(diǎn)最多.

2.3 亞洲小車蝗種群間遺傳多樣性分析

由表3可知，亞洲小車蝗15個(gè)地理種群的遺傳分化系數(shù)（FST）為0.0506～0.4028，正鑲白旗種群檢測(cè)到的FST值最小，烏拉特中旗種群檢測(cè)到的FST值最大，均值為0.1495；基因流（Nm）在0.2312～5.9336之間，固陽(yáng)種群檢測(cè)到的值最大，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群檢測(cè)到的值最小，均值為1.9880.結(jié)果表明，15個(gè)種群之間存在一定的基因交流和遺傳分化.

表3 內(nèi)蒙古亞洲小車蝗15個(gè)地理種群遺傳多樣性指數(shù)

2.4 單倍型分析

本文的75條序列中鑒定出8個(gè)單倍型（見(jiàn)表4），其中有3個(gè)共享單倍型和5個(gè)獨(dú)享單倍型.Hap1被除烏拉特中旗種群以外的其他14個(gè)種群所共享，頻率為0.6800；Hap2被固陽(yáng)種群與烏拉特中旗種群共享，頻率為0.0400；Hap3為克什克騰旗種群等9個(gè)種群所共享，頻率為0.2133；其他5個(gè)單倍型分別被烏拉特中旗種群、四子王旗種群、阿左旗種群和正鑲白旗種群獨(dú)享，頻率均為0.0133.四子王旗種群共有4個(gè)單倍型，在15個(gè)種群中最多；其次為烏拉特中旗種群，有3個(gè)單倍型；察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群均只檢測(cè)出1個(gè)單倍型，結(jié)果表明在各種群內(nèi)存在一定的遺傳分化.

由單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖1）可知，由四子王旗種群和正鑲白旗種群獨(dú)享的單倍型Hap5和Hap8分離出其他單倍型而存在，說(shuō)明四子王旗種群和正鑲白旗種群較其他種群變異程度大.Hap5經(jīng)6次變異形成Hap8，Hap6突變3次形成Hap3，Hap4和Hap7經(jīng)過(guò)4次突變均可形成Hap2.

表4 各單倍型頻率及在種群中的分布

2.5 遺傳距離和地理距離的相關(guān)性分析

使用TFPGA軟件對(duì)亞洲小車蝗15個(gè)種群的遺傳距離和地理距離進(jìn)行Mantel測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2、表5，回歸方程為y＝－8045.4 x＋565.8，相關(guān)系數(shù)r＝－0.1554（P＝0.8080＞0.05）.由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)研究的亞洲小車蝗15個(gè)種群間的遺傳距離與其地理距離間無(wú)顯著的相關(guān)關(guān)系.

圖1 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 內(nèi)蒙古亞洲小車蝗15個(gè)種群的遺傳距離與地理距離間的回歸分析

3 討論

本文測(cè)定的rDNA的288bp序列中G＋C含量高于A＋T含量，與GenBank中已知蝗蟲(chóng)的rDNA序列的堿基組成一致，但是與赤眼蜂［18］、褐飛虱、白背飛虱、灰飛虱［22］、米爾頓姬小蜂［23］的rDNA序列的堿基組成相反，與亞洲小車蝗線粒體基因［24］的堿基組成也相反，說(shuō)明不同物種之間的rDNA序列堿基組成存在差異，且同一物種不同基因的堿基組成同樣存在差異.

種群遺傳分化系數(shù)FST是種群間遺傳分化的重要指標(biāo).Wright指出，F(xiàn)ST＜0.05，說(shuō)明種群間分化很弱；0.05＜FST＜0.15，表示種群中等分化；0.15＜FST＜0.25，表示種群遺傳分化較大［25］.本文中FST平均值為0.1495，說(shuō)明15個(gè)種群間的遺傳分化處于中等水平，群體中有14.95%的變異來(lái)自種群間，而有85.05%的變異來(lái)源于不同個(gè)體之間，個(gè)體間的變異大于種群間變異，這與李東偉等［5］運(yùn)用RAPD和韓海斌等［12］運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)不同地點(diǎn)亞洲小車蝗遺傳多樣性研究的結(jié)果相似.

Whitlock和Mccauley認(rèn)為，種群間基因相互交流的增加會(huì)導(dǎo)致種群間遺傳分化的減?。?6］，所以，基因流Nm的存在是影響種群間遺傳分化的重要因素；Slatkin認(rèn)為，種群間的基因流可以阻止完全的基因固定和遺傳分化［27］.本文中Nm平均值為1.9880（1＜Nm＜4），15個(gè)種群間基因交流處于中等水平.

本文的研究結(jié)果表明，內(nèi)蒙古15個(gè)亞洲小車蝗種群的遺傳距離與地理距離無(wú)顯著相關(guān)性，這一結(jié)果與任竹梅等 對(duì)不同區(qū)域日本稻蝗Cytb基因序列和高書(shū)晶等 對(duì)亞洲小車蝗mtDNA ND1基因序列的研究結(jié)果一致.造成這一結(jié)果的原因可能是，本文所選的rDNA序列在遺傳上相對(duì)較為保守，進(jìn)化較慢，在不同地理區(qū)域的亞洲小車蝗間沒(méi)有達(dá)到足夠的變異；也可能是亞洲小車蝗的遷移能力較強(qiáng)，在不同地理種群間存在較強(qiáng)的基因交流.這一推論符合本實(shí)驗(yàn)對(duì)基因流的研究結(jié)果.李東偉等［5］和韓海斌等［12］運(yùn)用RAPD和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)不同地點(diǎn)亞洲小車蝗遺傳多樣性研究的結(jié)果顯示，不同地點(diǎn)的亞洲小車蝗種群的遺傳距離與地理距離具有顯著的相關(guān)性，說(shuō)明單一的基因序列所涵蓋的信息量難以實(shí)際反應(yīng)遺傳多樣性的全部規(guī)律［5，12］.因此，在下一步的研究中，應(yīng)該增加研究?jī)?nèi)容所涵蓋的信息量和樣本量，對(duì)分子系統(tǒng)學(xué)的研究進(jìn)行更深入的探討.

［1］張龍，嚴(yán)毓驊，王貴強(qiáng)，等.蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)病田間流行的初步調(diào)查［J］.草地學(xué)報(bào)，1995，3（3）：223－229.

［2］陳素華，烏蘭巴特爾，吳向東.內(nèi)蒙古草地蝗蟲(chóng)生存與繁殖對(duì)氣候變化的響應(yīng)［J］.自然災(zāi)害學(xué)報(bào)，2007，16（3）：66－69.

［3］許富禎，孟正平，郭永華，等.烏蘭察布市農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)亞洲小車蝗發(fā)生與防治［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2005，（7）：384－387.

［4］KANG L，CHEN Y L.Dynamics of grasshopper communities under different grazing intensities in Inner Mongolia steppes［J］.Entomologia Sinica，1995（2）：265－281.

［5］李東偉，高書(shū)晶，龐保平，等.內(nèi)蒙古地區(qū)亞洲小車蝗不同地理種群的 RAPD分析［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，2010，47（3）：472－478.

［6］高書(shū)晶，李東偉，劉愛(ài)萍，等.亞洲小車蝗不同地理種群遺傳多樣性的等位酶分析［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（10）：1967－1972.

［7］高書(shū)晶，韓靖玲，劉愛(ài)萍，等.亞洲小車蝗和黃脛小車蝗不同地理種群的RAPD遺傳分化研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（2）：94－100.

［8］高書(shū)晶，李東偉，劉愛(ài)萍，等.不同地理種群的亞洲小車蝗mtDNA COⅠ基因序列及其相互關(guān)系［J］.草地學(xué)報(bào)，2011，19（5）：846－851.

［9］高書(shū)晶，劉愛(ài)萍，韓靜玲，等.不同地理種群的亞洲小車蝗mtDNA ND1基因序列及其相互關(guān)系［J］.應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2011，48（4）：811－819.

［10］邰麗華，賈建宇，王塔娜，等.內(nèi)蒙古中東部地區(qū)亞洲小車蝗3個(gè)種群的遺傳多樣性分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（1）：122－126.

［11］BERTHIER K，LOISESU A，STREIFE R，et al.Eleven polymorphic microsatellite markers for Oedaleusdecorus（Orthoptera：Acrididae），an endangered grasshopper in Central Europe［J］.Molecular Ecology Resources，2008（8）：1363－1366.

［12］韓海斌，周曉蓉，龐保平，等.內(nèi)蒙古亞洲小車蝗種群遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2013，56（1）：79－87.

［13］張仁利，耿藝介，黃達(dá)娜，等.深圳市白紋伊蚊rDNA－ITS2區(qū)克隆及SNP分析［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7（1）：8－11.

［14］MILLER B R，CRABTREE M B，SAVAGE H M.Phylogeny offourteen Culex mosquito species，including the Culex pipiens complex，inferred from the internal transcribed spacers of ribosomal DNA［J］.Insect Molecular Biology，1996，5（2）：93－107.

［15］JI Y J，ZHANG D X，HE L J.Evolutionary conservation and versatility of a new set of primers for amplifying the ribosomal intermal transcribed spacer（ITS）regions in sects and other invertebrates［J］.Molecular Ecology Notes，2003，3（4）：581－585.

［16］王莉萍，杜予州，何雅婷，等.不同地理種群美洲斑潛蠅及近緣種的rDNA－ITS1序列分析和比較［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2007，50（6）：597－603.

［17］唐伯平，周開(kāi)亞，宋大祥.核rDNA ITS區(qū)序列在無(wú)脊椎動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2002，37（4）：67－73.

［18］李正西，沈佐銳.赤眼蜂分子鑒定技術(shù)研究［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2002，45（5）：559－566.

［19］KUMAR S，TAMURA K，NEI M.MEGA3：integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5（2）：150－163.

［20］ROZAS J，SáNCHEZ－DELBARRIO J C，MESSEGUER X，et al.DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods［J］.Bioinformatics，2003，19（18）：2496－2497.

［21］CLEMENT M，POSADA D，CRANDALL K A.TCS：a computer program to estimate gene genealogies［J］.Molecular ecology，2000，9（10）：1657－1659.

［22］劉玉娣，林克劍，韓蘭芝，等.基于rDNA ITS1和ITS2序列的褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱的分子鑒定［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2009，52（11）：1266－1272.

［23］黃蓬英，廖富榮，林玲玲，等.米爾頓姬小蜂rDNA ITS1和ITS2的序列分析及其分子鑒定［J］.應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2012，49（2）：448－453.

［24］MA C，LIU C X，YANG P C，et al.The complete mitochondrial genomes of two band－winged grasshoppers，Gastrimargus marmoratus and Oedaleus asiaticus［J］.BMC Genomics，2009，10：1－12.

［25］WRIGHT S.Evolution and the genetics of populations（Vol.4）：variability within and among natural populations［M］.Chicago and London：University of Chicago Press，1978.

［26］WHITLOCK M C，MCCAULEY D E.Indirect measures of gene flow and migration：FST≠1／（4 Nm＋1）［J］.Heredity，1999，82：117－125.

［27］SLATKIN M.Gene flow and the geographic structure of natural population［J］.Science，1987，236：787－792.

［28］任竹梅，馬恩波，郭亞平.不同區(qū)域日本稻蝗Cytb基因序列及相互關(guān)系［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（3）：244－248.